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日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是由节肢动物传播的虫媒病毒,人类在被感染的蚊子叮咬时会受到感染,引起永久性的神经和/或精神后遗症、甚至死亡。JEV属于黄病毒科黄病毒属,是一种包膜病毒,其基因组为长度约11kb的单股正链RNA,两端为5′非编码区和3′非编码区（untranslated region,UTR）,中间的开放阅读框（open reading frame,ORF）编码3种结构蛋白（C、Pr M和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。黄病毒基因组3′UTR的起始区序列保守性低,称为可变区（variable region,VR）。一方面,VR区的改变可能影响病毒RNA的折叠,进而干扰病毒的复制;另一方面,低保守性的VR区能够容纳一定长度的外源序列,进而赋予病毒新的生物学功能;因此,探究JEV的VR区的结构和功能的关系,将加深我们对JEV复制机制的认识,也能为基于JEV的病毒载体的设计和改造提供新思路。为此,本研究在前期构建获得的JEV感染性克隆的基础上,首先通过分子生物学操作对JEV的3′UTR的5′端进行了改造,获得了能够方便外源序列整合至VR区操作的新的重组克隆;在此基础上,尝试将丙型肝炎病毒基因组中的具有刺激天然免疫应答功能的多聚U/UC基序插入JEV的VR区,拯救获得了系列VR缺失或插入的重组病毒,并对重组病毒基本的生物学性质进行了评价。一.重组日本脑炎病毒基因组全长c DNA克隆的构建与鉴定利用本实验室的反向遗传学的技术,基于前期构建的日本脑炎病毒全长感染性克隆p JE70质粒,选择p JE70线性化酶切位点Xho I及终止密码子上游的单酶切位点Xba1,设计PCR引物扩增出分片段,分片段利用融合PCR扩增出含有Kpn1酶切位点的融合片段。融合片段酶切后通过体外连接转化感受态细胞,提取质粒获得p JE70＿Kpn1。对构建获得的p JE70＿Kpn1质粒进行初步的鉴定。参照上述方法,以p JE70＿Kpn1质粒为模板,在病毒基因组3′非编码区的终止密码子后20nt、40nt、60nt、80nt、100nt分别引入poly U/UC,构建获得基因组3′非编码区不同位置携带poly U/UC的日本脑炎病毒全长克隆。我们将突变病毒质粒的转录体RNA转染BHK-21细胞拯救并获得恢复病毒,经测序鉴定后发现多聚U/UC基序完全丢失,但VR区发生部分缺失或插入,携带该突变的突变病毒也能够稳定传代。二.3′非编码区VR突变的日本脑炎病毒的生物学性质鉴定为了初步探究3′非编码区VR区序列的插入/缺失的突变对病毒的生物学特性的影响。基于VR区突变的碱基数,将日本脑炎突变病毒分别命名为:DEL12、DEL10、INS8。通过体外细胞感染实验和小鼠实验,我们将突变病毒与亲本株E70-Kpn1进行了病毒的蚀斑形态、在不同细胞中的增殖特性、在小鼠体内的神经毒力和神经侵袭力分析等生物学特性差异的鉴定。实验结果显示:在BHK-21细胞上,突变病毒形成的蚀斑大小直径与亲本株E70-Kpn1相似,无明显差异;在BHK-21和SH-SY5Y细胞系中,突变病毒的复制水平与E70-Kpn1无显著差异;在小鼠实验中,50PFU/只和5PFU/只剂量下,突变病毒对小鼠的神经毒力与其亲本株无显著差异,10~6PFU/只和5×10~6PFU/只剂量下,突变病毒对小鼠的神经侵袭力与其亲本株无显著差异。神经毒力和神经侵袭力的评价需要进一步探究。综上,我们成功构建了携带Kpn1单酶切位的日本脑炎病毒全长感染性克隆,并拯救获得相应的重组日本脑炎病毒,该重组病毒的体外增殖特性和小鼠神经毒力与亲本株并无显著差异。在此基础上,通过将多聚U/UC元件插入VR区的方法,拯救获得了系列VR发生缺失和插入的突变病毒,初步的生物学性质分析的结果显示,该系列突变病毒的噬斑形态、细胞中的复制能力与亲本株无显著差异,但其神经毒力和神经侵袭力有所增强。本研究构建获得的携带单酶切位点的重组克隆为VR区的设计和改造提供了研究工具,VR区的缺失和插入诱发的神经致病性的改变的具体机制值得深入研究,有望为VR结构和功能的认识提供新的科学数据。