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目的：目前我国现有的可移植瘤株及用于药效试验的小鼠瘤株有限,特别是小鼠膀胱肿瘤瘤株稀缺。实验一是通过喂饲OH-BBN方法诱发Balb/c小鼠膀胱癌,初步建立Balb/c小鼠膀胱癌细胞系BBN1617,为膀胱肿瘤的基础研究、实验治疗和抗癌新药筛选提供一个有价值的动物模型。实验二通过构建虫荧光素酶报告基因重组表达质粒pSin-EF2-luciferase,将荧光素酶报告基因转入到EJ细胞中,筛选检测后以获得稳定表达的细胞株,用于小鼠膀胱原位移植瘤的活体成像监测。方法：一、OH-BBN诱发Balb/c小鼠膀胱癌及BBN1617细胞系的初步建立1.Balb/c小鼠膀胱肿瘤的OH-BBN诱导：6周龄雄性Balb/c小鼠,随机分为2组,膀胱癌诱导为实验组(15只),给予含有0.05%OH-BBN的饮用水24周,饮用水中的致癌物一周更换2次。对照组(10只),给予自来水喂养。两组共喂养24周后都以自来水喂养。2.Balb/c小鼠膀胱癌BBN1617细胞系的初步建立：获取膀胱肿瘤组织后,进行HE染色镜下观察,胶原酶消化法进行膀胱肿瘤原代培养和传代培养。3.Balb/c小鼠膀胱癌BBN1617细胞系的初步鉴定：采用细胞生长曲线和病理观察等方法确定细胞增殖状态和生长周期。4.包埋法将OH-BBN诱发肿瘤接种于Balb/c小鼠背部皮下进行传代培养,对移植瘤HE染色观察。二、虫荧光素酶标记的人膀胱癌细胞系EJ-LUC的构建1.利用PCR的方法扩增虫荧光素酶基因使其具备特定的CGGACTAGT接头,以连接、转化、提取质粒等方法克隆入pSin-EF2载体以获得入门克隆。2.产物经PCR及测序鉴定正确后,构建重组表达质粒pSin-EF2-luciferase,琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。3.转染HEK293T包装细胞得到重组慢病毒。重组慢病毒经过扩增后,感染人膀胱癌EJ细胞,筛选后检测荧光素酶报告基因蛋白活性。4.将稳定表达荧光素酶报告基因的EJ细胞体外扩增培养,经尿道灌注至裸小鼠膀胱腔,活体成像系统采集图像。结果：一、OH-BBN诱发Balb/c小鼠膀胱癌及BBN1617细胞系的初步建立1.喂饲至25周成瘤率为66.67%(10/15),对照组成瘤率0。处死小鼠并解剖后可见膀胱瘤灶部位颜色苍白,凸出表面,并失去弹性。体视镜下见肿瘤浸润膀胱肌层,呈外生型或浸润型生长。2.HE染色见细胞肿瘤核仁1-2个,核仁大,有分裂相,胞质深染。原代培养的膀胱肿瘤细胞传代培养3代后出现胞核和胞质均增大(“油煎蛋”样外观)。3.体外培养的小鼠膀胱癌细胞生长曲线呈浅“S”形,3-5天进入对数生长期。4.Balb/c小鼠皮下接种OH-BBN诱发的膀胱肿瘤瘤块约1周便可成瘤,移植瘤HE染色和体外培养的生长曲线与原代膀胱肿瘤无明显差异。二、虫荧光素酶标记的人膀胱癌细胞系EJ-LUC的构建1.PCR扩增带有特定引物的虫荧光素酶报告基因,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物大小约1617bp,与目标基因片段大小一致。2.将虫荧光素酶克隆入pSin-EF2载体,并将其转化至e.coli感受态细胞。挑选5个氨苄抗性的单菌落摇菌培养,菌液PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳鉴定得到1617bp大小片段。重组质粒pS in-EF2-luci ferase测序结果证实目的基因虫荧光素酶报告基因的序列与Genbank公布的结果完全符合。3.采用美国Promega公司的虫荧光素酶活性检测试剂盒进行Lentivirus-luci功能活性的鉴定：结果证明本研究构建的Lentivirus-luci能稳定表达虫荧光素酶。4.膀胱内灌注含虫荧光素酶报告基因的EJ细胞,活体成像系统下可以明确看到裸小鼠膀胱内肿瘤细胞显像。结论：一、OH-BBN诱发Balb/c小鼠膀胱癌及BBN1617细胞系的初步建立1. OH-BBN喂饲法可以成功诱发Balb/c小鼠膀胱肿瘤。2.诱发的小鼠膀胱肿瘤可以体外原代培养、传代培养和皮下成瘤,HE染色证实诱发肿瘤和皮下移植瘤均为膀胱癌。3.皮下移植瘤体外传代培养细胞与原代膀胱肿瘤的传代培养细胞无明显不同,细胞生长曲线均符合恶性肿瘤细胞生长特点。二、虫荧光素酶标记的人膀胱癌细胞系EJ-LUC的构建1.成功构建虫荧光色素酶报告基因重组质粒pSin-EF2-luciferase。2.琼脂糖凝胶电泳入门克隆产物和菌液PCR产物,经鉴定与目标基因一致,均为1617bp大小产物。3.构建的虫荧光色素酶报告基因重组质粒pSin-EF2-luciferase能够将荧光素酶报告基因转染至EJ细胞并且稳定表达,可以用于小鼠活体成像观察。4.裸小鼠膀胱腔内灌注的EJ-LUC细胞可以活体显像。