肿瘤的复发和耐药是临床治疗失败的主要因素,针对中晚期复发转移的肿瘤患者,化疗、免疫治疗等是临床的治疗策略。但药物治疗后的耐药、特别是化疗药物产生的多药耐药(Multidrug resistance,MDR)一直是困扰临床治疗的重大难题。MDR的机制复杂,主要有:药泵蛋白高表达、凋亡机制变化、代谢重编程的改变等。针对耐药机制的研究已有深入报道,但能够应用于临床的有效策略并不多。因此寻找新的治疗策略、降低药物的毒副反应依然是目前亟待解决的问题。我们对易产生骨转移的前列腺癌细胞PC3及多西他赛(Docetexal,Doc)诱导的多药耐药细胞PC3/Doc进行了基因表达差异谱分析,通过Gene Ontology(GO)分析发现,耐药细胞代谢途径变化明显,其中以细胞器溶酶体相关基因的变化最为显著。因此本论文重点探讨了溶酶体在多药耐药中的作用、化疗药物对溶酶体的调控机制,并筛选对溶酶体有调控作用的小分子化合物,包括有一定前期研究基础的天然双联苄类化合物,以及筛选分析靶向溶酶体的双联苄化合物RDN(the aminomethylated derivative of Riccardin D)的作用靶点和克服多药耐药的机制。论文研究利用组学数据、The Cancer Genome Atlas(TCGA)大数据平台,以及液相色谱、蛋白质谱等技术对溶酶体相关的耐药关键基因的作用进行了细致分析,确定新的耐药机制及潜在的治疗靶标,并根据靶标进行新药的筛选。为临床肿瘤治疗、克服耐药提供新的实验依据。第一部分:TFE3促进溶酶体代谢重编程参与肿瘤的多药耐药一、耐药细胞发生代谢重编程,其中以溶酶体的变化最为显著,更新加快且活性增加1、PC3/Doc耐药细胞中溶酶体更新加快、数目显著增加前列腺癌细胞PC3细胞及其多药耐药细胞PC3/Doc的基因表达差异谱芯片结果显示,耐药细胞中溶酶体相关基因变化明显。透射电镜和Lyso-tracker的免疫荧光结果显示,耐药细胞中溶酶体、自噬溶酶体的数目显著增加,线粒体的数目也显著增加。通过qPCR和Western blotting对溶酶体的marker基因进行分析,结果表明,溶酶体相关的膜蛋白 1(lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1)、溶酶体相关的膜蛋白 2(lysosomal-associated membrane protein 2,LAMP2)、溶酶体钙离子通道蛋白1(Mucolipin,MCOLN1)、溶酶体囊泡分选蛋白 18(vacuole protein sorting,VPS18)、溶酶体内的组织蛋白酶 B(cathepsin B,CTSB)、组织蛋白酶 D(cathepsin D,CTSD)、组织蛋白酶 L(cathepsin L,CTSL)以及溶酶体离子通道蛋白 ATP6V1H(ATPase,H+transporting,lysosomal 50/57kDa,V1 subunit H,ATP6V1H)的表达显著增加;同时初级溶酶体的marker蛋白RAB5水平在耐药细胞中也显著提高,表明溶酶体在耐药细胞中更新增加。另外,自噬溶酶体的marker如ATG5、LC3B的表达也呈上升趋势,确定耐药细胞中溶酶体的更新速率、数目显著增加。2、耐药细胞中溶酶体活性增加为了检测耐药细胞中溶酶体数目的增加,是否伴随着活性加强,我们利用酶活性分析,检测溶酶体酸性鞘磷脂(acid sphingomyelinase,ASM)的活性。结果显示,耐药细胞PC3/Doc中ASM的活性显著高于亲本细胞PC3。同时溶酶体内的组织蛋白酶B的活性形式在耐药细胞中也明显升高,进一步证实耐药细胞溶酶体的代谢旺盛。3、不同作用机制和靶点的临床化疗药物都可促进溶酶体代谢为明确溶酶体在耐药过程中的变化是否具有普遍性,我们进一步检测了多株耐药细胞系:鼠源前列腺癌细胞RM1及其Doc诱导的多药耐药细胞株RM1/Doc;肺癌细胞H460及其紫杉醇(paclitaxel,Tax)诱导的多药耐药细胞H460/Tax;人口腔上皮细胞癌细胞KB及其长春新碱(vincristine,VCR)诱导的多药耐药细胞KB/VCR。Lyso-Tracker染色结果显示,虽然药物不同,耐药的肿瘤细胞不同,但所有耐药细胞中溶酶体的数目都呈现不同程度的增加,表明多种化疗药物均可促进溶酶体代谢。为了进一步证实溶酶体在多药耐药中的变化,我们构建异种移植小鼠荷瘤模型,经过化疗药物多西他赛(Doc),长春新碱(vincristine,VCR),依托泊苷(etoposide,VP16)以及阿霉素(Doxorubicin,Dox)的两次化疗后,诱导成功小鼠耐药模型。qPCR和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)结果表明,这些化疗药物都不同程度的诱导LAMP2、VPS18、ATP6V1H和CTSL的表达,证实化疗药物促进肿瘤细胞发生代谢重编程、促进溶酶体代谢,使得溶酶体在获得性多药耐药的过程中呈现更新增加、代谢增强的趋势。4、溶酶体相关基因高表达与多种肿瘤的预后呈负相关我们利用TCGA数据库确定耐药细胞溶酶体增加是否具有临床意义。数据分析发现,溶酶体相关的基因如LAMP2、ATP6V1H、CTSL、VPS18的高表达与常见肿瘤的预后均无正相关,且普遍存在明显的负相关。如LAMP2高表达与乳腺癌、膀胱癌呈负相关,CTSL高表达与肺癌呈负相关,VPS18高表达与膀胱癌、肺癌、结直肠癌呈负相关等。因此溶酶体增加与患者预后呈现负相关。提示其可以作为潜在的预后指标及治疗靶点。二、多西他赛通过激活Transcription factor E3(TFE3)促进溶酶体基因的表达和溶酶体的生成转录因子 microphthalmia-transcription factor E(MiT/TFE)家族成员,特别是TFEB、TFE3在调控溶酶体生成中的重要作用格外引人注目,相关研究已经证实TFEB、TFE3通过调控大多数溶酶体相关基因表达而控制溶酶体的生物合成。通常TFEB、TFE3磷酸化滞留在胞质中,而脱磷酸化后入核、发挥转录因子的功能,促进溶酶体相关基因的表达从而调控溶酶体的生成。我们首先确定耐药细胞中溶酶体的增加的机制是否与TFEB、TFE3有关。1、化疗药物能够激活TFE3,促进溶酶体生成1)多西他赛显著激活TFEB、TFE3而促进溶酶体生成由于化疗药物处理后溶酶体的数量和活性均显著增加,我们首先分析Doc是否在发挥抗肿瘤作用的同时能够激活TFEB、TFE3,从而调控溶酶体代谢。Western blotting的结果表明,在前列腺癌耐药细胞株中,TFE3多以低磷酸化的形式存在。利用siRNA下调TFEB或TFE3的表达,Lyso-Tracker的结果显示,下调TFEB或下调TFE3都可明显降低耐药细胞溶酶体的荧光强度。qPCR结果显示,下调TFEB或TFE3,耐药细胞中LAMP1、LAMP2、VPS18以及CTSB的表达均降低,证实TFEB或TFE3调控耐药细胞溶酶体代谢,似乎TFE3的作用更明显。为了进一步明确TFE3是否在药物应答过程中具有更突出的作用,PC3细胞经过Doc处理后,可促进TFEB、TFE3的入核,且TFE3的入核更为明显,且随着药物作用时间的延长,二者的入核进一步增加,且TFE3更为显著。另外,293T细胞过表达TFEB、TFE3,并经Doc处理后,明显诱导TFEB、TFE3的入核,且TFE3的入核蓄积更为显著,表明耐药细胞中TFE3可能发挥更为重要的作用。2)多种化疗药物诱导的耐药过程伴随TFE3的活化耐药动物模型的免疫组化染色结果也显示,TFE3也在阿霉素、长春新碱、VP16等化疗药物诱导的耐药肿瘤组织中入核显著增加,具有普遍性,进一步证实TFE3可能在获得性耐药的产生过程中发挥更为重要的作用。2、多西他赛通过激活钙调磷酸酶促进TFE3的入核激活新近研究指出,多西他赛Doc可通过诱导反应活性氧ROS的产生,促进TFEB的入核。首先我们检测了 PC3及耐药细胞PC3/Doc中ROS的水平,发现耐药细胞中ROS显著低于亲本细胞,表明耐药细胞中ROS并非是调控TFE3的关键因素。mTOR、Akt等激酶的失活可导致TFEB、TFE3的脱磷酸而入核活化。Western blotting结果显示,调控TFE3的几个重要激酶在耐药细胞中多以活性形式存在,p-mTORC1表达升高,p-AKT,p-GSK3β无显著变化,并无降低趋势,因此耐药细胞中激酶可能不是TFE3脱磷酸的关键调控因子。我们随后分析耐药细胞中磷酸酶是否活化导致TFE3的脱磷酸激活。酶活性检测结果显示,钙调磷酸酶(Calcineurin,CaN)在耐药细胞中活性增高,钙调磷酸酶抑制剂FK520可抑制钙调磷酸酶活性、可部分逆转TFE3的脱磷酸入核。因此化疗药物不抑制有关细胞增殖存活的激酶信号,而磷酸酶CaN的活性增强是TFE3活化的机制之一,尚存在其它调控机制。三、溶酶体膜定位的药泵蛋白MRP2通过脱靶机制介导多西他赛耐药1、TFE3促进化疗的多药耐药化疗药物通过激活TFE3而促进溶酶体的生成,我们首先确定TFE3的驱动作用是否直接参与了化疗耐药。耐药细胞PC3/Doc中TFE3、TFEB高表达,而降低TFE3或TFEB的表达都可增加耐药细胞对化疗药物Doc、Dox的敏感性,且下调TFE3后增敏效果更为突显。在亲本细胞PC3中过表达TFE3或TFEB均增加细胞对化疗药的耐受,其中TFE3的高表达对化疗药物的耐受更为明显。2、TFE3可能通过调控溶酶体而参与耐药由于TFE3高表达对多种药物产生耐受,而药泵蛋白是不依赖于药物结构而介导多药耐药的的重要机制,因此我们首先分析TFE3是否通过影响细胞的药物蓄积参与耐药。药物在细胞内的蓄积实验结果显示,耐药细胞内药物蓄积明显减少,但过表达TFE3或降低TFE3均不影响细胞对药物的蓄积能力,表明TFE3参与化疗耐药,但并不通过细胞膜药泵蛋白介导的耐药机制。TFE3作为上游关键因子可能通过调控溶酶体而增加肿瘤的耐药。3、化疗药物滞留于溶酶体中导致脱靶耐药溶酶体参与耐药的主要机制是通过滞留阳离子药物于溶酶体中,例如Dox,顺铂等被滞留于溶酶体,导致药物脱离原有靶点(如Dox和顺铂均为DNA损伤药物,主要在细胞核发挥作用),进而产生脱靶耐药。我们首先确定耐药细胞旺盛的溶酶体是否可滞留Doc、Dox而导致脱靶耐药。通过分离细胞器,利用液相色谱层析技术分析Doc在细胞中的分布。结果显示,Doc主要分布在亲本细胞PC3的细胞胞液,而耐药细胞PC3/Doc中,Doc在细胞胞液内的浓度远低于PC3,而且Doc在耐药细胞溶酶体的蓄积显著增加。同样,Dox主要分布在细胞核,在溶酶体内也有分布,在耐药细胞溶酶体内的蓄积显著高于敏感细胞的溶酶体。因此耐药细胞溶酶体增多导致药物滞留其中而产生脱靶耐药的作用。4、耐药细胞药泵蛋白MRP2高表达且可定位于溶酶体膜而介导化疗药物的滞留于溶酶体中导致脱靶耐药1)MRP2在耐药细胞中高表达并参与化疗耐受药泵蛋白是产生药物蓄积的主要机制。基因表达差异谱结果显示,前列腺癌耐药细胞PC3/Doc中多种药泵蛋白呈现不同程度的表达上调,如ABC41、ABCA12、ABCB1,ABCG2等。经qPCR、流式细胞分析药泵膜蛋白的表达,虽然ABCB1基因在耐药细胞高表达,但其蛋白产物P-gp并无表达(与文献一致,前列腺癌PC3细胞不表达P-gp),最后确定多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,MRP2)(基因为ABCC2)的蛋白表达上调明显,而且Doc也是MRP2的底物。免疫荧光显示,MRP2主要在胞质中高表达。而下调MRP2可显著增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。2)MRP2可定位在溶酶体膜由于MRP2在胞质中高表达,我们利用激光共聚焦确定其细胞定位。结果表明,MRP2在细胞胞液中分布广泛且可以和溶酶体的膜蛋白LAMP2共定位,提示MRP2可定位于溶酶体。通过分离溶酶体进一步证实MRP2可定位于溶酶体。3)TFE3调控MRP2的表达MRP2属质子泵的跨膜蛋白且可定位于溶酶体膜,而根据文献报道,TFE3的靶基因中富集最显著的为溶酶体质子泵蛋白,我们进一步分析TFE3促进溶酶体介导的耐药是否通过调控MRP2的表达和定位来完成药物在溶酶体的蓄积。我们首先分析TFE3对MRP2是否具有调控作用。结果显示,降低TFE3可以部分逆转Doc、Dox诱导的ABCC2以及ABCB1的表达,而过表达TFE3可以增加Doc、Dox诱导的ABCC2以及ABCB1的表达。Western blotting检测结果显示,MRP2也可定位在溶酶体,且受TFE3的调控,过表达TFE3可以增加MRP2在溶酶体的表达以及溶酶体特异性标志蛋白LAMP2、RAB7的表达,伴随着增加Dox在溶酶体的蓄积、减少其在胞液的含量。因此,TFE3可以通过增加溶酶体的表达以及MRP2的表达和溶酶体定位,进而影响药物在细胞内的分布,导致脱靶耐药。第二部分双联苄化合物RDN靶向溶酶体分子靶点的分析及逆转耐药的作用机制在第一部分的研究中,我们已经明确多数的化疗药物可以激活TFEB或TFE3,进而通过溶酶体介导肿瘤的多药耐药。为此我们以前期筛选并确定药效和毒性的潜力双联苄类化合物为基础,进一步筛选并确定可调控或靶向“TFEB/TFE3-溶酶体-多药耐药”通路的小分子化合物。双联苄化合物Riccardin D的氨甲基衍生物Riccardin D-N(RDN)是我们前期筛选的带有阳离子的化合物,可以靶向溶酶体,引起溶酶体的通透,介导细胞死亡,但其作用机制及靶标不详。我们首先分析RDN对耐药细胞溶酶体的影响以及对逆转耐药的药效;其次确定RDN引起溶酶体通透,诱导DNA损伤的作用机制;最后通过对RDN进行标签修饰,利用IP/MS筛选出RDN的分子靶标VPS18,并对其功能进行了初步分析。一、双联苄化合物RDN与溶酶体靶向药物具有逆转耐药作用1、耐药细胞对靶向溶酶体的化合物更敏感针对耐药细胞中溶酶体增多的表型,我们分析耐药细胞对溶酶体靶向药物的应答。与PC3细胞相比,耐药细胞PC3/Doc对Doc耐受,但对靶向溶酶体的小分子化合物RDN、羟基氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)以及盐霉素(salinomycin,SAL)更为敏感,在相同的浓度下,RDN更易诱导耐药细胞凋亡。另外,RDN在较低浓度(2μM)时即可明显损伤耐药细胞的溶酶体,而SAL(15μM)、HCQ(25μM)则需要较高浓度,提示RDN可能具有更好的应用前景。2、针对同一细胞器的双靶点药物具有明显协同作用药物增敏及合成致死效应是目前,克服单一用药效果差、用药量高、毒副作用大等缺点的一种策略。针对耐药细胞以溶酶体为主的代谢变化明显的特点。我们对一些溶酶体靶向(RDN、SAL、HCQ、Dox)和线粒体靶向(Syrosingopine,Syr、metformin,Met、2-Deoxy-D-glucose,2-DG、BPTES)的小分子化合物进行了联合应用筛选。通过对联用药物的CI(combinatory index)曲线(CI<1,代表有协同作用,值越小协同作用越强)分析,我们发现针对同一细胞器的靶点化合物普遍具有协同作用,而针对不同细胞器的靶点化合物之间的协同效果不理想。其中Syr与Met、BPTES与Syr、RDN与SAL这三对组合具有显著的协同作用。其中Syr与Met联用效果在16年Science的一篇文献中已有报道。本文着重分析了RDN与SAL的联用效果。BPTES与Syr的联用相关工作目前也在进行。3、RDN与SAL具有协同增效作用,并显著降低SAL毒副作用体外的CI曲线分析,RDN与SAL具有显著的协同作用,为进一步验证两者的协同逆转肿瘤多药耐药作用及临床应用前景。我们构建异种移植瘤耐药动物模型。结果显示,针对耐药肿瘤模型,Doc(5 mg/kg)的治疗效果差,且毒性大(小鼠实验期间出现死亡,且肝肾功指标增高)。而RDN(20 mg/kg)和SAL(10 mg/kg)具有抑制肿瘤的作用,但SAL的副作用较大(小鼠实验期间出现死亡,且肝肾功指标增高)。而两者的低剂量的联用(10 mg/kg RDN与1 mg/kg SAL)可显著抑制肿瘤增长(瘤体积明显减小、活体成像荧光强度最弱、Ki67阳性率最低),同时降低SAL的毒副作用(小鼠体重与对照无差异,肝肾功指标明显改善)。二、双联苄化合物RDN诱导溶酶体通透、促进CTSB入核并介导BRCA1的降解而诱导肿瘤细胞凋亡前期我们已经确定RDN可以靶向溶酶体,通过引起溶酶体的通透,介导细胞死亡,但其作用机制及靶标不详。为此我们进行了进一步的研究。1、RDN阻断自噬体和溶酶体的融合,诱导耐药细胞溶酶体通透溶酶体酸性鞘磷脂酶(ASM)不仅可以反应溶酶体的活性,同时也可以代表溶酶体膜的稳定性。我们首先分析RDN对ASM的影响,结果显示,RDN显著降低耐药细胞ASM的活性。进一步利用GFP-RFP-LC3质粒进行荧光分析,发现RDN和溶酶体靶向药物羟基氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)作用相似,可引起溶酶体通透,阻断自噬体和溶酶体的融合。Western blotting的结果显示,自噬标志物LC3BII/LC3B Ⅰ的转换显著增加,自噬受体P62累积。结合前期数据,确定RDN可阻断自噬体与溶酶体的融合,诱导耐药细胞溶酶体通透。2、RDN促进CTSB入核而加剧DNA损伤我们前期已确定RDN可通过诱导DNA损伤,引起细胞凋亡。进一步分析RDN诱导DNA损伤的机制时发现,RDN处理细胞后,从溶酶体释放的CTSB可定位到细胞核。而CTSB的抑制剂可以部分逆转RDN诱导的DNA损伤及细胞凋亡,表明CTSB是介导RDN诱导DNA损伤的关键因子之一。3、RDN介导的CTSB入核可促进BRCA1降解CTSB作为酶蛋白入核可促进DNA损伤,我们随后分析其与DNA损伤修复的关联。Western blotting结果显示,RDN可降低损伤修复蛋白BRCA1的表达,而过表达CTSB可降低BRCA1水平、显著加强DNA损伤标志蛋白γ-H2AX、凋亡水平增加(PARP的剪切增加)。为验证CTSB在核内的功能依赖于其酶活功能,我们构建了 CTSB的278和298两个酶活位点双突变的质粒(ΔCTSB),该突变CTSB不影响CTSB的前体表达,但其成熟的活性形式消失,对BRCA1、γ-H2AX、PARP几乎无影响。4、CTSB的入核机制依赖于核信号斑由于CTSB没有经典的核定位信号,其如何定位在细胞核内研究较少。根据最新的文献报道,CTSB在成熟过程中,可形成信号斑,介导其入核。为此我们构建了其信号斑缺失的截断质粒(CTSB-ΔNLS-GFP)。免疫荧光结果显示,在293T中过表达CTSB-GFP,经RDN处理后可促进CTSB的入核,而CTSB-ΔNLS-GFP在RDN刺激的情况下无法入核。Western blotting结果进一步证实,表达CTSB-ΔNLS-GFP后,RDN引起的BRCA1的降解、DNA的损伤均得到缓解,表明CTSB介导的BRCA1的降解依赖于其核定位信号斑。三、双联苄化合物RDN的分子靶标及机制研究1、RDN可直接靶向溶酶体VPS18蛋白1)RDN-Bio探针的制备及活性检测为了明确RDN的作用靶标,我们通过化学方法对RDN进行了 Biotin的标签修饰,得到RDN-Bio探针化合物。MTT结果显示,带有Biotin标签的小分子探针化合物RDN-Bio可浓度依赖的抑制耐药细胞存活,且其抑制活性优于RDN。激光共聚焦检测发现,RDN-Bio可与溶酶体实现很好的共定位,表明RDN及RDN-Bio是具有良好抑制作用的溶酶体靶向化合物。2)筛选确定RDN的作用靶标是VPS18我们通过IP/MS方法筛选分析RDN可能结合的目标蛋白。耐药细胞经Biotin、RDN-Bio处理后,通过免疫共沉淀实验发现在RDN-Bio处理组中100KD左右的位置发现一条特异性条带。对条带进行蛋白质谱分析,发现溶酶体Vacuolar protein sorting-associated protein 18(VPS 1 8)可能是 RDN 的作用靶标。利用免疫共沉淀实验进行验证,结果表明,RDN-Bio可与VPS18紧密结合,并且阻断VPS18和VPS16的结合,即阻断VPS核心复合物的组装。由于VPS核心复合物介导溶酶体与自噬体的融合,此结果证实RDN可阻断自噬溶酶体的融合与成熟。3)RDN结合VPS18的RING结构域并阻断VPS核心复合物的组装为了明确RDN和VPS18的结合位点,我们分别构建VPS18的结构域截短突变质粒(VPS18A1-Flag,VPS18Δ2-Flag,VPS18Δ3-Flag,VPS1 8Δ4-Flag,VPS18Δ5),CO-IP实验结果表明,RDN-Bio结合在VPS18的RING结构域。2、VPS18在多种肿瘤中高表达,并与不良预后及耐药有关1)VPS18在多种肿瘤组织中高表达VPS18在疾病中的作用少有研究报道,为了明确VPS18是否具有临床意义、是否可以作为肿瘤治疗的分子靶标,我们收集了不同肿瘤患者的癌组织与癌旁组织(前列腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌),通过qPCR及免疫组化分析其表达情况。结果显示,VPS18在前列腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌的表达显著高于癌旁组织。2)VPS18与肿瘤患者的预后成负相关利用TCGA数据库进行分析,结果显示,VPS18高表达与多种肿瘤的不良预后相关,包括膀胱癌、肺癌、结直肠癌。而VPS其他家族成员如VPS11、VPS16、VPS33A,除了 VPS16与膀胱癌患者的预后成正相关外,其他则无相关性,提示VPS18可作为预后的检测指标,具有临床应用潜力。3)VPS18参与化疗耐受VPS18作为RDN的靶标,且在多种常见恶性肿瘤中高表达,我们进一步分析VPS18是否与耐药有关。Western blotting的结果显示,VPS18在前列腺癌耐药细胞PC3/Doc、肺癌耐药细胞H460/Tax以及膀胱癌耐药细胞J82/Doc中的表达都明显上调,而VPS16只在PC3/Doc中上调明显。分析前期构建的耐药动物模型的瘤组织发现,VSP18也都呈现不同程度的上调。MTT的结果表明,过表达VPS18可以增加细胞对化疗药物的耐受,而下调VPS18则可增加细胞对化疗药的敏感性。因此VPS18与肿瘤的预后、化疗耐药有关,其病理作用机制尚需进一步研究。3、TFE3可转录调控VPS18的表达1)VPS18作为VPS-C核心复合物的关键组分,其在肿瘤及耐药细胞的高表达是否与TFE3有关。qPCR的结果显示,VPS18受TFE3的转录调控,过表达TFE3可明显上调VPS18的表达,表明VPS18是TFE3的下游调控基因,这也与之前其他课题组筛选结果相一致。2)VPS18影响溶酶体的成熟。Lyso-Tracker染色结果显示,下调VPS18会导致溶酶体的数目减少。Western blotting结果显示下调VPS18,显著降低LAMP2、下调CTSB的活性形式,但不影响RAB5的表达。RFP-GFP-LC3双荧光报告基因的染色结果发现,下调VPS18可阻断雷帕霉素诱导的自噬溶酶体的形成。因此,VPS18与溶酶体的成熟及通透有关。第三部分双联苄化合物地钱素M诱导耐药细胞衰老并调控衰老的炎性分泌表型在第一部分的研究中,我们已经明确多数的化疗药物可以激活TFEB或TFE3,进而通过溶酶体介导肿瘤的多药耐药,为此我们以前期筛选并确定药效和毒性的潜力双联苄类化合物为基础,进一步筛选并确定可调控或靶向“TFEB/TFE3-溶酶体-多药耐药”通路的小分子化合物。在第二部分的研究中我们已经明确溶酶体靶向的双联苄化合物RDN可以通过靶向VPS18,引起溶酶体通透,释放CTSB入核,加剧DNA损伤,进而诱导细胞凋亡。同时,在对双联苄的筛选过程中,我们惊喜的发现双联苄化合物地钱素M(Marchantin M,Mar-M)可显著降低TFEB的表达,而且低浓度下可以通过诱导耐药细胞衰老的机制克服耐药。衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等组成,它们通过旁分泌的方式对微环境产生影响:既可募集免疫细胞用于清除衰老细胞、发挥抑癌作用;同时分泌的促炎因子、水解酶也可导致邻近组织细胞的增殖、侵袭转移等,促进肿瘤恶化。我们前期已证实Mar-M具有显著的抗炎作用,抑制IL1、IL6、TNF-alpha等。因此,我们首先明确Mar-M促进耐药细胞衰老的作用及机制、是否抑制SASP的表达分泌,以确定其是否能成为潜力药物用于克服耐药、降低肿瘤的复发转移。一、双联苄化合物地钱素M显著降低耐药细胞TFEB,促进耐药细胞的凋亡和衰老1、地钱素M显著抑制耐药细胞TFEB,诱导耐药细胞的凋亡和衰老筛选对耐药细胞有应答的化疗药物、天然小分子化合物的结果显示,多数药物促进TFEB、TFE3的表达和/或活性升高,但地钱素M(Mar-M)显著降低TFEB的表达和入核,并且Mar-M处理后,耐药细胞不仅出现凋亡,而且呈现衰老样表型。通过浓度筛选分析,发现低浓度的Mar-M可显著诱导耐药细胞衰老,优于其他双联苄化合物。二、地钱素M通过抑制蛋白酶体活性诱导耐药细胞衰老1、低浓度Mar-M主要通过p21信号通路引起细胞周期阻滞周期阻滞是细胞衰老的特征之一。Western blotting的结果显示,低浓度Mar-M可明显增加p21、p27的表达,β-gal的染色结果显示,下调p21可逆转Mar-M引起的衰老,而下调p27并无显著的逆转效应。2、低浓度Mar-M通过抑制蛋白酶体,引起DNA损伤,诱导耐药细胞衰老我们前期确定较高浓度Mar-M(10 μM)可抑制蛋白酶体活性、诱导DNA损伤及细胞凋亡。低浓度Mar-M(1μM)是否影响蛋白酶体活性。酶活性测定结果显示,低浓度的Mar-M仍可明显抑制肽基谷胺酰多肽水解酶(Glutamine peptide hydrolases)及胰凝乳样蛋白酶(Chymotrypsin)活性,对蛋白酶体胰蛋白酶(Trypsase)活性影响不大。为进一步明确蛋白酶体在Mar-M诱导的衰老中的重要作用。我们过表达蛋白酶体亚基后观察了 Mar-M诱导的衰老相关表型变化。IF、Western blotting结果显示,低浓度Mar-M可诱导DNA损伤,γ-H2AX的表达增加,而过表达蛋白酶体亚基后可逆转Mar-M引起的DNA损伤。β-gal的染色结果显示,过表达蛋白酶体亚基后可明显逆转Mar-M诱导的细胞衰老。三、地钱素M通过抑制TFEB,进而抑制炎性SASP1、低浓度Mar-M抑制炎性SASP通过低剂量化疗药物诱导肿瘤细胞衰老,是目前肿瘤治疗的新策略。但也存在一些副作用,例如衰老相关分泌因子(SASP)的表达。特别是其中的炎性因子在诱导肿瘤的复发转移中起到了重要作用。我们前期已证实Mar-M具有显著的抗炎作用,抑制IL1、IL6、TNF-alpha等。因此我们首先检测了低浓度Mar-M在诱导耐药细胞衰老的同时,是否仍具有抗炎的作用。我们收取PC3/Doc加Mar-M和Dox处理5天后的上清进行QAH-INF-1芯片检测。蛋白芯片显示,Mar-M组与对照组相比,炎症因子IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8呈下调趋势,而Dox组,炎性细胞因子IL-1α,IL-1β,IL-6上调明显。同时我们通过qPCR进行了进一步的验证,低浓度Mar-M在转录水平即可抑制炎性因子的表达。以上结果表明,相比于传统的化疗药物,Mar-M在诱导耐药细胞衰老的同时,也可抑制炎性SASP的分泌,提示Mar-M具有更好的应用前景。2、低浓度Mar-M通过抑制TFEB的表达抑制SASP的分泌跟据最新的文献报道,TFEB可以参与炎症反应,调控炎症因子的表达。而我们前期的筛选数据也表明Mar-M可明显抑制TFEB的表达。于是我们猜想Mar-M调控炎性SASP的下调是否是通过TFEB介导的。在耐药细胞中下调TFEB,发现IL-1α,IL-1β,IL-6的表达均有所下调。表明TFEB对耐药细胞的炎性因子有直接的调控作用。低浓度Mar-M可明显抑制TFEB的表达,对TFE3的表达无明显的影响。IF的结果进一步证实低浓度Mar-M可抑制TFEB的入核。为进一步证实Mar-M调控SASP的表达是依赖于TFEB的,我们在293T中过表达TFEB可部分逆转Mar-M引起的炎性因子的下调。3、Mar-M可抑制SASP的旁分泌效应、具有抑制肿瘤复发转移的潜力为进一步验证Mar-M的应用潜力,我们进行了体内的药效学验证。我们首先构建了可以用于体内验证旁分泌效应的动物模型。简述如下,我们首先在小鼠的左腋下种植RM 1/Doc细胞,成瘤后分别给予Mar-M和Dox连续给药两周后停药,将每组的小鼠分成三部分进行后续实验。第一部分,小鼠停药后,取瘤组织进行冰冻切片,进行衰老染色,用于验证Mar-M在体内诱导衰老的效果。第二部分,在小鼠右侧腋下接种RM 1/Doc-Luc细胞。10天后进行活体成像检测。用于验证Mar-M对SASP引起的促肿瘤增殖的影响。第三部分,不做任何处理,继续检测老鼠体重与生存状况。1)Mar-M在体内仍能诱导耐药细胞衰老。对Mar-M和Dox处理后的瘤块进行衰老染色,结果显示,Mar-M在体内仍能诱导耐药细胞衰老。2)Mar-M在体内仍可抑制炎性SASP,进而抑制其旁分泌促肿瘤增殖的作用。对Mar-M和Dox处理后小鼠的血清进行Elisa分析发现,Mar-M在体内仍能明显抑制炎性因子IL-1α,IL-1β,IL-6的表达,而Dox组的表达明显上调。活体成像显示,在Mar-M处理组,右侧腋下接种的RM 1/Doc-Luc细胞荧光强度明显降低,成瘤能力减弱,对瘤块进行进一步的Ki67染色发现,其阳性着色也明显减少。而Dox处理组,无论是荧光强度还是Ki67阳性率都明显增强。以上结果表明,Mar-M在体内仍可抑制SASP的表达,进而抑制其旁分泌效应,具有抑制肿瘤复发转移的潜力。3)Mar-M能明显延长小鼠的生存。体重的分析检测发现,Dox处理组小鼠的体重随着给药次数的延长,体重明显下降。表明其存在明显的毒副作用。而Mar-M处理组与对照体重无明显差异。提示Mar-M的毒副作用较小。生存分析显示相比于对照组和Dox处理组,Mar-M可以明显的延长小鼠的存活时间。以上结果提示Mar-M具有更好的临床应用前景,可作为逆转肿瘤耐药的候选潜力化合物。第四部分结论、创新点及不足之处一、论文的结论1、溶酶体代谢重编程是获得性耐药的机制之一(1)化疗药物通过激活MiT/TFE家族成员、特别是TFE3活化,促进溶酶体的更新与合成而参与肿瘤多药耐药。(2)耐药细胞中,多西他赛滞留于溶酶体导致脱靶耐药。(3)MRP2是TFE3的下游靶基因之一,而耐药细胞高表达的MRP2可定位于溶酶体,从而改变多西他赛在细胞内的定位产生耐药。2、溶酶体靶向药物能够显著克服获得性耐药(1)RDN通过靶向VPS18逆转耐药。(2)VPS18在多种肿瘤及耐药细胞中高表达并与预后成负相关,可作为一种新的肿瘤治疗靶点。(3)RDN与SAL具有明显的协同抗肿瘤作用,降低药物的毒副作用。(4)Mar-M能下调耐药细胞TFEB的表达和活化,抑制溶酶体更新和合成。(5)低浓度Mar-M通过抑制蛋白酶体活性、诱导DNA损伤从而诱导耐药细胞衰老,逆转耐药,且毒副作用小。(6)低浓度Mar-M通过抑制炎性SASP的表达,抑制其旁分泌效应,降低肿瘤的复发转移,延长小鼠的生存期。二、论文的创新性(1)首次报道TFE3及调控的溶酶体重编程参与多种化疗耐药。(2)首次报道多西他赛Doc可以被溶酶体滞留,导致脱靶耐药。(3)首次报道TFE3可调控MRP2,而MRP2可定位在溶酶体膜上进而影响药物的亚细胞定位,导致脱靶耐药。(4)首次报道双联苄化合物RDN的分子靶点为VPS18,并确定RING结构域是RDN与之结合的区域。(5)首次报道VPS18在多种肿瘤中高表达,可作为肿瘤治疗的新靶点及预后指标。(6)首次报道Mar-M能下调TFEB,通过抑制SASP的表达,抑制其旁分泌的负面效应。三、论文的不足之处(1)TFE3调控MRP2的分子机制不清,但相关工作正在进行。(2)VPS18的生理及病理功能需进一步研究。(3)Mar-M调控TFEB的分子机制需进一步研究。