背景过敏性鼻炎是一种气道慢性炎症性疾病,其本质上是一种由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、上皮细胞等)、炎性介质和细胞因子网络共同参与的变态免疫反应性疾病。鼻炎作为危害各年龄段人群健康的复杂性、难治性重大疾病,其发病率呈逐年上升趋势,是当前研究的热点之一。中医药治疗过敏性鼻炎具有悠久的历史和自身特色,其在弥补了西药抗过敏时效短、停药后易复发及多种副作用缺点后,在不断的医疗实践中被人们认可。其中中药外治法又有其独特的优势,它不仅可以达到内服药类似的治疗效果,并且在预防鼻炎发作和鼻炎缓解期的治疗中发挥重要的作用。本课题所使用的麻芥巴布膏是一种新型外用剂型,药物组成包含由麻黄、白芥子、延胡索、苦杏仁、生姜汁。麻芥巴布膏作为一种治疗鼻炎的新型制剂,需要对其临床疗效、动物药效及作用机制进行研究。因此,本课题将从麻芥巴布膏的临床病例研究、网络药理学研究、药效作用和免疫调控机制研究四个方面展开,从而评价麻芥巴布膏的治疗效果并阐释其部分作用机理。目的1、通过临床收集过敏性鼻炎患者,观察麻芥巴布膏干预后的临床疗效。2、通过网络药理学研究,挖掘麻芥巴布膏潜在核心靶点,预测麻芥巴布膏作用通路。3、通过制备BN大鼠鼻炎模型,给予药物治疗,观察麻芥巴布膏对鼻炎动物模型的药效作用。4、通过制备BN大鼠鼻炎模型,观察麻芥巴布膏对MAPK通路、TSLP、Th1/Th2平衡及粘膜连接蛋白的影响,阐释其免疫调控机制。方法1、收集肺虚感寒型过敏性鼻炎患者48例,给予麻芥巴布膏背部穴位贴敷治疗4周后,根据视觉模拟量表观察患者喷嚏、鼻痒、流涕、鼻塞症状改善情况,根据疗效评分标准初步评定麻芥巴布膏的临床疗效。2、通过TCMSP数据库分别查询麻黄、杏仁、白芥子、延胡索、生姜的成分化合物及对应靶标,通过NCBI Gene数据库查询鼻炎靶标。将麻芥巴布膏靶基因和鼻炎靶基因融合,并通过数据库构建蛋白相互作用网络。从蛋白作用网络中提取核心靶点,采用DAVID数据库对相互作用蛋白进行通路富集分析,选取麻芥巴布膏调控鼻炎的具体作用通路。3、使用OVA致敏BN大鼠制备鼻炎动物模型,共分为4组:空白组,模型组,西替利嗪组(17.5mg/kg/d),麻芥巴布膏穴位贴敷组(6.65g/kg/d),每组10只。模型制备成功后,药物干预6周。治疗期间观察行为学变化。治疗结束后,采用瑞氏吉姆萨染色方法对全血嗜酸性粒细胞进行计数;采用甲苯胺蓝染色方法观察肥大细胞浸润;使用HE染色方法观察鼻粘膜病理学变化;采用ELISA法检测血清及灌洗液中IgE、组胺的含量。4、采用 Western Blot 法分别检测 ERK、p38、TSLP、T-bet、GATTA、E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平;采用流式细胞术检测全血Th1/Th2细胞数目;使用ELISA法检测IFN、IL-4、IL-5、IL-13 和 TSLP 含量。结果1、临床疗效观察:随着麻芥巴布膏干预时间的延长,喷嚏、鼻痒、鼻塞、流涕症状均得到了有效缓解。疾病疗效总有效率达到75%,并伴随鼻粘膜、分泌物等体征的缓解。中医证候有效率达到79.17%,并伴随自汗、畏风怕冷、咳嗽痰稀等肺虚感寒型症状的缓解。2、网络药理学分析结果:通过查询TCMSP数据库,查找得到人源靶蛋白498个(麻黄131个、杏仁117个、延胡索177个、白芥子46个、生姜27个),鼻炎相关人源基因364个。采用Cytoscape进行靶蛋白相互作用融合并提取核心靶点,筛选得到74个核心靶点,涉及气道炎症、信号传导、免疫与反应、物质合成与代谢、气道重塑、基因遗传等功能。采用DAVID数据库进行通路富集分析得出MAPK通路作为麻芥巴布膏潜在调控通路,并对其进行后续实验验证。3、药效学结果:(1)行为学评价:治疗6周后,西替利嗪组与麻芥巴布膏组均能降低激发后喷嚏症状,与模型组相比,麻芥巴布膏降低具有显著性差异。治疗6周后,西替利嗪组与麻芥巴布膏组均能降低激发后挠鼻症状,与模型组相比,麻芥巴布膏组降低具有显著性差异。(2)全血嗜酸性粒细胞计数:麻芥巴布膏治疗组和西替利嗪组均能减少OVA致敏鼻炎大鼠外周血嗜酸性粒细胞数,与模型组相比,麻芥巴布膏治疗组外周血嗜酸性粒细胞数减少具有显著性差异。(3)鼻粘膜组织HE染色显示:模型组大鼠鼻黏膜结构紊乱,纤毛粗细不一,有明显脱落,上皮细胞排列混乱,杯状细胞增多,黏膜下层周围腺体及血管扩张增生,有充血及组织水肿,并可见嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润,显示出黏膜重塑的特征。西替利嗪组鼻粘膜较模型组有明显改善,粘膜较为完整平滑,组织水肿缓解,仅有少量炎性细胞浸润。麻芥巴布膏组较模型组亦有明显改善,粘膜恢复完整平滑,仅有轻微水肿和少量炎性细胞浸润。(4)鼻粘膜甲苯胺蓝染色:模型组则可看到大量肥大细胞浸润,部分细胞胞浆颗粒释放至细胞膜外,西替利嗪组与麻芥巴布膏组肥大细胞明显减少。(5)血清IgE及组胺含量:麻芥巴布膏可降低血清IgE及组胺含量,与模型组相比,血清IgE降低具有显著性差异,组胺降低具有显著性差异,并且与西替利嗪相比均无统计学差异。(6)灌洗液IgE及组胺含量:麻芥巴布膏可降低灌洗液IgE及组胺含量,与模型组相比,灌洗液IgE降低无统计学差异,组胺降低具有显著性差异,并且与西替利嗪组相比均无统计学差异。4、免疫机制研究结果:(1)流式细胞结果:麻芥巴布膏可升高Th1细胞数目,其显著高于模型组。麻芥巴布膏可降低Th2细胞数目,并且显著低于模型组。(2)WB检测结果:麻芥巴布膏可降低鼻粘膜ERK、p38、TSLP、及GATA的蛋白表达,提高T-bet、E-cadherin、β-catenin蛋白表达。(3)ELISA检测结果:麻芥巴布膏可降低血清中IL-4、IL-5、IL-13和TSLP含量,提高IFN含量。结论1、麻芥巴布膏对过敏性鼻炎肺虚感寒型患者具有一定的临床疗效。2、网络药理学方法分析预测得到MAPK通路在麻芥巴布膏治疗鼻炎时起到重要作用。3、麻芥巴布膏可抑制鼻炎动物模型挠鼻、喷嚏过敏症状,并通过抑制炎症细胞浸润,降低IgE、组胺含量,起到对鼻炎的治疗作用。4、麻芥巴布膏通过抑制ERK和p38的磷酸化及TSLP的含量,并对处于免疫下游的Th1/Th2平衡及相关细胞因子表达进行调控,实现对E-cadherin和β-catenin功能保护,来减轻局部鼻粘膜炎症。