牙周病是指发生在牙支持组织的疾病,包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织的牙周炎两大类。是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一,也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病之一。牙周病与许多系统性疾病如,血管疾病、糖尿病、低体质量早产儿、消化系统疾病等存在着密切的相关性,成为许多系统性疾病的潜在危险因素。因此,及时的治疗牙周病对于预防系统性疾病的发生,提高人民的生活质量具有重要的意义。牙周病作为慢性、非特异性、感染性疾病,其主要感染源为细菌。而牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)是牙周病的重要致病菌,与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关。P. gingivalis是革兰阴性短杆菌,专性厌氧、无芽胞、无动力,存在毒力株和无毒株,无毒株形成了口腔正常的微生态群,而毒力株则成为牙周病的重要致病菌。同时也发现毒力株中存在rag基因座(ragA和ragB),该基因座低(G+C)摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件,而且rag基因座有4种等位基因型,存在遗传多态性。因此,明确口腔疾病患者P. gingivalis基因型的分布,阐明rag基因座的来源,对于有效地诊断、清除P. gingivalis感染,防治牙周疾病的发生,提高人民生活质量具有重要意义。目的(1)已有研究发现P. gingivalis是牙周炎的重要致病因子,与心血管疾病、消化系统疾病、低体重早产儿、超敏反应及自身免疫性疾病等系统性疾病的发生、发展密切相关,严重影响人民生活健康。那么镇江地区牙周病患者P. gingivalis感染情况如何?已有研究提示rag基因座为P. gingivalis致病岛重要的组成部分,具有遗传多态性。因此,通过本研究的实施,阐明镇江地区口腔疾病患者P. gingivalis感染率及其与牙周病的关系；明确镇江地区流行性P. gingivalis基因型。(2)rag基因座作为P. gingivalis致病岛的重要组成部分,具有rag1-4等四种基因型,该基因座低GC摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件,这均提示P. gingivalis rag基因座有可能经水平传播获得,在该基因的进化过程其驱动力如何,有待研究证实。因此,通过本研究的实施,从理论上阐明P. gingivalis rag基因座来源的理论基础及其进化的驱动力。(3)鉴于P. gingivalis有致病性和非致病性之分,非致病性P.gingivalis是口腔微环境正常菌群；而致病性P. gingivalis存在rag基因座,与牙周病以及许多系统性疾病的发生密切相关,严重影响人民的身体健康。rag基因座具有遗传的多态性。那么开展针对P. gingivalisrag基因座的预防治疗是否可以切断rag基因的来源,防止致病性牙龈卟啉菌的扩散,有效地的清除牙龈卟啉菌的感染呢?值得进一步探讨,本研究旨在阐明rag外膜蛋白的免疫原性,为其以后疫苗的研究奠定基础。方法(1)镇江地区口腔疾病患者P. gingivalis的感染率及其rag基因的分布收集来医院就诊的口腔疾病患者龈沟液,热煮沸法提取基因组DNA,利用P. gingivalis特异性的16sRNA扩增P. gingivalis,分析其在镇江地区口腔疾病患者中的流行率及其与牙周病发生、发展的关系；设计针对P. gingivalis不同rag基因座亚型的PCR引物,多重PCR方法分析镇江地区流行的P. gingivalis rag基因型。(2) P. gingivalis rag基因座溯源分析分别利用已报道的P. gingivalis ragA-1和ragB-1蛋白序列作为靶序列采用PSI-BLAST搜索策略在美国国立生物技术信息中心蛋白数据库中搜索其相关序列。采用Clustal X软件进行序列比对、校正、去除空格后；采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)、最小进化法(Minimum-Evolution, ME)构建系统进化树,bootstrap值通过检测1000次获得；并利用PAML软件进行选择压力分析。(3) P. gingivalis rag基因的克隆、表达和纯化以P. gingivalis W50基因组为模板,利用PCR扩增目的基因ragB;用BamH I和Hind III双酶切ragBPCR扩增产物,整合至质粒pET-32a(+),重组质粒转化感受态大肠埃希菌Rosetta。挑取阳性克隆,经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切鉴定,将阳性重组子命名pET-32a-ragB;随机挑取含测序正确重组子的单个菌落接种于3mL含有终浓度100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃振荡培养过夜。次日按1：100接种于新鲜的LB液体培养基(100mg/L氨苄青霉素),37℃振荡培养达菌液OD600为0.4到0.6时,加入终浓度0.5mmol/LIPTG,30℃振荡培养下诱导4h、6h、8h。分别收集菌液12000r/min离心1min,弃上清,菌体用80 u L生理盐水重悬,冰上超声处理至混合液澄清。以12g/dl的SDS-PAGE分析融合蛋白的最佳诱导条件及表达形式(4) P. gingivalis rag蛋白的纯化和鉴定对大量诱导表达的蛋白,以Ni-NTA亲和层析柱纯化；并用Western-blot进行鉴定。(5) P. gingivalis rag蛋白多克隆抗体的制备及效价鉴定将纯化的融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀并充分乳化后,每只100 μg蛋白皮下多点注射家兔,两周后用不完全弗氏佐剂加强免疫2次,方法同前,之后再经耳静脉加强免疫数次,于末次免疫一周后颈动脉放血、分离血清,常规间接ELISA法测定抗血清效价。(6) P. gingivalis外膜蛋白ragB-GITRL真核共表达载体的构建及免疫原性分析应用PCR扩增技术,从pMD18-T-ragB中获得ragB基因编码序列片段,克隆至真核共表达载体pIRES及pIRES-mGITRL。对重组质粒进行双酶切与测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot检测其在COS7细胞中的表达。将成功构建的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗RagB的水平。结果(1)在110例病人中有29例检测到P. gingivalis,这29例中有1例来自于慢性局部性牙周炎、9例来自于广泛性慢性牙周炎、19例来自于坏死性牙周炎；在29例P. gingivalis感染的病人中,19例检测到rag基因。其中10例为rag1型、6例为rag2型、3例为rag3型,在镇江地区没有检测到rag4型；19例rag基因检出病人中,18例来自于坏死性牙周炎病人,1例来自于广泛性慢性牙周炎病人。在19例rag基因检出病人中,有3人患有糖尿病,5人患有心血管系统疾病。(2)153个rag蛋白同源序列从美国国立生物技术信息中心蛋白数据库中搜索到,利用DAMBE软件去除冗余的序列后50个蛋白序列后,采用NJ、ME法构建系统进化树。由系统进化树可以看出有明显的三个分支,分别命名为(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),该系统进化树每个分支具有统计学意义；P. gingivalis ragA其无义突变和有义突变的比值(dN/dS=0.23); P. gingivalis ragB其无义突变和有义突变的比值dN/dS=0.19)。(3)以P.gingivalis基因组为模板,采用特异性ragB引物,通过PCR扩增得到目的基因,经10g/L的琼脂糖凝胶电泳证实,获得一条大约1506bp大小的特异性条带,与预期目的片段大小相符；将胶回收的PCR扩增产物及pET-32a(+),分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,回收目的片段ragB和载体pET-32a(+),然后用T4连接酶连接构建成重组质粒pET-32a-ragB；克隆出的目的基因测序显示,其编码区为1506bp,编码501个氨基酸残基。与GenBank已收录的序列(AJ130872)一致。(4)pET-32a-ragB转化的大肠埃希菌Rosetta菌株,经IPTG诱导后其表达蛋白的SDS-PAGE电泳显示：在30℃、200rpm、终浓度0.5mmol/L IPTG诱导6h条件下,融合蛋白表达达到高峰,蛋白条带位于分子量约74kDa处；该融合蛋白主要以可溶性形式存在；镍柱纯化后得到单一条带的目的蛋白。用抗-His mAb进行Western blot鉴定,证实该蛋白条带为RagB融合蛋白。(5)共免疫2只家兔,分离的血清经间接ELISA法检测,两份抗血清效价分别为1:320000和1:160000。(6)PCR扩增目的基因,酶切和测序证实重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL成功构建,Western blot结果显示目的基因在COS7细胞及肌细胞中均过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗RagB的抗体。结论(1)镇江地区P.gingivalis检出率较低,但在坏死性牙周炎中检出率较高,与牙周炎的发生、发展相关;P.gingivalis rag基因具有多态性,该基因的分布具有明显的地域性差异,镇江地区以rag-1型为主。(2)已有研究显示rag基因座为P.gingivalis致病岛的重要组成部分,仅存于致病性P. gingivalis中；且该基因座具有低(G+C)摩尔百分数、侧端有可移动元件和插入元件；因此,推测该基因座可能经基因水平转移获得。为证实以上假说,从基因数据库中搜索其相关序列,从生物信息学的角度证实rag基因座经水平传播获得,在该基因的遗传过程没有经受任何选择性的压力。(3)既然P. gingivalis具有致病性和非致病性菌株,致病性P.gingivalis含有rag基因座,为其致病岛的重要组成部分,那么该基因座是否能够成为新型的P. gingivalis疫苗侯选；该基因座是否能够有效地的触发免疫应答或者是参与P. gingivalis免疫逃逸机制；有鉴于此,克隆、表达了rag蛋白,同时构建了pIRES-ragB-mGITRL表达载体,为牙龈卟啉菌疫苗研究、预防和牙周炎治疗提供了实验依据。(4) P. gingivalis具有致病性和非致病性之分,非致病性P.gingivalis为口腔正常菌群的重要组成部分；rag基因座为P. gingivalis致病岛的重要组成部分；且rag基因经水平传播获得；因此,开展针对rag基因座的治疗对于预防口腔疾病及其系统疾病的发生,提高人民生活质量具有重要的意义。有鉴于此,制备了针对P. gingivalis rag基因座的多克隆抗体,初步研究表明该抗体具有保护作用。