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目的通过oligo化学合成及PCR扩增法合成人显性抑制TGF-βⅡ型受体(Dominant-negative transforming growth factor-βreceptorⅡ, DNTβRⅡ)目的基因,构建pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ真核表达质粒；利用Nucleofector技术将质粒转染NK-92细胞,观察阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞的体外抗肿瘤效应；建立裸鼠荷Calu-6人肺癌细胞皮下移植瘤模型,观察阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞过继性治疗的体内抗肿瘤效应。方法(1)根据Genebank数据库确定DNTβRⅡ目的基因,利用化学合成法进行单链oligo的合成,PCR法将合成的oligo拼接成完整的序列,装入PMD18-T载体并转染感受态细胞DH5α,经XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体pIRES2-AcGFP中,酶切电泳和DNA测序鉴定,转染COS-7细胞,倒置荧光显微镜观察GFP表达。(2)流式细胞术检测NK-92细胞TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体表达情况,ELISA法检测Calu-6、A-549、MDA-MB231和HT-29四种肿瘤细胞系的TGF-β1分泌水平；采用Nucleofector技术将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和pIRES2-AcGFP对照质粒转染NK-92细胞,流式细胞术、RT-PCR法及倒置荧光显微镜检测DNTβRⅡ在NK-92细胞的转染及表达,western blot险测转染后NK-92细胞Smad2蛋白的活化状态；将分泌水平最高的Calu-6细胞系与TGF-β1(终浓度10ng／m1)共孵育24小时,CCK-8法比较转染后的NK-92细胞对Calu-6人肺癌细胞系的体外杀伤活性。(3)采用细胞悬液接种法,将Calu-6细胞(1×106)接种于裸鼠背部皮下；成瘤实验同期经尾静脉分别输注转染pIRES2-AcGFP的NK-92细胞(B组)和转染pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ的NK-92细胞(C组),A组不予另外处理,接种后第10天比较各组成瘤率；抑瘤实验于接种后第10天、17天经尾静脉进行2次过继性输注,分为生理盐水组(a组)、NK92／pIRES2-AcGFP组(b组)和NK92／pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ组(c组),接种第56天处死动物；比较各组皮下移植瘤体积、生存期变化及外周血IFN-γ水平,肺转移情况。结果(1)合成DNA经测序验证与目的基因一致,真核表达质粒pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ转染后,倒置荧光显微镜证实DNTβRⅡ在COS-7细胞的表达。(2)Calu-6细胞系在四种肿瘤细胞系中TGF-β1表达水平最高；流式细胞术证实了NK-92细胞表面TβRⅠ、TβRⅡ的高表达；采用Nucleofector技术,pIRES2-AcGFP和pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒对NK-92细胞的转染效率分别为28.53%和18.86%,RT-PCR和倒置荧光显微镜证实了DNTβRⅡ的表达,western blot显示虽有TGF-β的刺激,转染pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒的NK-92细胞未见Smad2蛋白的活化。Calu-6细胞与TGF-β1共孵后,NK-92细胞对Calu-6细胞的杀伤活性较共孵前明显减弱(p<0.001)：转染DNTβRⅡ阳性质粒的NK-92细胞对Calu-6细胞杀伤活性明显高于GFP转染组(p<0.001)。(3)成瘤实验显示3组间成瘤率存在差异,C组成瘤率低于A组(p<0.05)。抑瘤实验表明转染DNTβRⅡ阳性质粒的NK-92细胞(c组)过继性治疗后裸鼠皮下移植瘤体积缩小,肺转移率下降,生存期明显延长,外周血IFN-γ水平明显增高。结论(1)成功构建pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ真核表达质粒,为阻断NK-92细胞的TGF-β信号通路提供了载体；(2)Nucelofector核转染技术实现了pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒在NK-92细胞的有效转染和表达；(3)pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒的转染在受体水平阻断了NK-92细胞的TGF-β信号通路；(4)阻断TGF-β信号通路的NK-92细胞能够在体外抵抗TGF-β的免疫抑制作用；(5)阻断TGF-β信号通路能够明显增强NK-92细胞过继性治疗的体内抗肿瘤效应；(6)改善肿瘤微环境中的免疫抑制作用,可能增强过继性免疫细胞治疗的临床疗效。