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细胞癌变时癌细胞膜上糖蛋白的寡糖链发生改变,即糖基异常变化。各种异常的糖蛋白糖基可影响细胞的正常功能,如细胞的识别和黏附功能障碍,这是导致细胞恶性转化的分子基础。随着基因组学、凝集素和质谱等技术在糖链检测中的应用,发现了许多与肿瘤相关的糖链结构。β1,6分支是细胞膜复杂型N-糖链的一种分支结构,文献报道在结肠癌和肝癌细胞中β1,6分支高表达,并且与预后差和肿瘤转移程度具有相关性,动物实验表明β1,6分支能够促进肿瘤细胞在小鼠体内的转移能力;体外实验证明β1,6分支高表达的细胞运动能力明显增强。但最近有文献报道在膀胱癌中β1,6分支的表达与预后较好有关,在神经母细胞瘤中高表达GnT-V能够促进肿瘤细胞的凋亡等等。因此β1,6分支在肿瘤转移中的作用以及作用机制有待于进一步研究。本论文的研究目的是观察在小鼠乳腺癌细胞4TO7中β1,6分支表达的差异对与肿瘤转移相关的细胞行为学的影响,并初步探讨其对细胞迁移能力影响的机制。为肿瘤细胞膜糖链β1,6分支与肿瘤转移的关系研究提供了新的实验依据,为今后深入阐明β1,6分支对肿瘤细胞迁移影响的机制奠定基础。第一部分:细胞表面β1,6分支糖链对小鼠乳腺癌细胞肿瘤转移相关行为学的影响本部分实验用RNA干扰的方法构建了GnT-V表达差异的两株小鼠乳腺癌细胞4TO7-siRNA3和4TO7-mock,并对它们的转移相关细胞行为学进行了研究。首先针对小鼠GnT-V的DNA序列设计并构建了用于转染小鼠乳腺癌4TO7细胞的干扰质粒:pSilencerU6-siRNA1, pSilencerU6-siRNA2和pSilencerU6-siRNA3。用以上质粒转染细胞并挑取阳性单克隆。获得了细胞表面表达β1,6分支降低约60%的细胞模型:4TO7-siRNA3。然后运用划痕法、Transwell小室法检测了4TO7-siRNA3细胞迁移行为的改变;用Metrigel模拟细胞外基质,检测了4TO7-siRNA3细胞侵袭行为的改变;运用细胞黏附实验检测了细胞与细胞外基质FN黏附能力的改变;最后用荧光标记的鬼比环肽检测细胞迁移时微丝的变化。结果表明:相对于阴性对照4TO7-siRNA3细胞与FN黏附增强,迁移和侵袭能力降低,而且β1,6分支表达降低能够影响细胞骨架actin的解聚和聚合功能。第二部分:高表达β1,6分支糖链增强小鼠乳腺癌细胞4TO7迁移能力的机制探讨本部分以β1,6分支对EGFR的影响为切入点对β1,6分支表达增高能够显著增强小鼠乳腺癌细胞4TO7迁移能力的机制进行了初步探讨。在表皮生长因子EGF的刺激下4TO7-mock细胞的迁移分为两个阶段,8小时之后迁移速度存在着一个明显的突跃。本部分实验检测了4TO7-siRNA3和4TO7-mock细胞上EGFR表达水平和EGFR上β1,6分支修饰, EGF刺激下两株细胞迁移时EGFR的磷酸化、PKC-δ和Erk信号的激活情况,结果表明:EGFR上增加了的β1,6分支糖链修饰能够增强迁移的第二个阶段中Erk和PKC-δ的信号强度,而抑制了与细胞骨架调节密切相关的RhoA的信号。β1,6分支通过增加EGFR的糖链修饰,进而影响其下游信号通路信号的持续增强,从而影响与细胞迁移相关的调节信号。这可能是β1,6分支糖链促进肿瘤细胞迁移的重要机制之一。