产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药菌自2010年被传染病领域国际顶级杂志《柳叶刀》报道以来,以惊人的传播速度和超强的耐药性引起人们的广泛关注。目前,在全球范围内已有超过20个国家出现产NDM耐药菌病例,除南美洲西部、非洲中部个别国家未报道外,其他国家和地区均有报道。携带blaNDM基因耐药菌对包括碳青霉烯类的常用抗菌药物均耐药,尚缺乏明确的治疗方案。研究发现,NDM-1有NDM-2到NDM-16共15个突变体,多由不动杆菌属细菌、大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌携带。越来越多的数据表明产NDM耐药菌已在全球范围流行并引发多种类型感染,是威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。因此,有效控制和治疗产NDM耐药菌感染具有重要现实意义。细菌耐药监测是防控产NDM耐药菌的重要组成部分,及时准确了解产NDM耐药菌的流行现状和特点,是预防和控制产NDM耐药菌感染的关键所在。既往研究发现,我国主要以携带blaNDM-1基因的不动杆菌为主,而关于其他NDM型别和其他菌属在我国的流行特点,研究报道甚少。为更全面了解产NDM耐药菌在我国的流行现状、流行规律及传播机制,本课题对2010年至2015年期间来自全国11个省市、25家医院的1559株非重复碳青霉烯类耐药菌(含医院污水来源156株)进行分析检测,采用聚合酶链式反应(PCR)法筛查blaNDM基因,运用流行病学及统计分析方法对不同来源、不同菌属、不同型别产NDM耐药菌引起感染性疾病的三间分布进行分析;利用基于全基因组平均核苷酸一致性(ANI)分析法及16sRNA序列分析对产NDM耐药菌进行菌种鉴定,利用核心基因组多位点序列分型(cgMLST)方法,对不同菌属产NDM耐药菌进行聚类分型;VITEK2全自动微生物药敏分析仪对携带blaNDM基因菌株进行耐药性分析;同时,利用Southern blot杂交法、滤膜接合法和细菌全基因组测序分别对其进行blaNDM基因定位及转移特性、blaNDM基因周边结构分析,以期明确中国部分地区产NDM耐药菌的分子特征,从分子水平解释产NDM耐药菌blaNDM基因可能的传播和流行规律。本研究的主要结果和结论如下:1.不同型别、不同菌属产NDM耐药菌已在中国部分地区流行播散。1559株实验菌中筛查出77株携带blaNDM基因菌株,阳性率为4.9%。1)时间分布特点:患者来源耐药菌的blaNDM基因阳性率逐年升高。2)空间分布特点:我国东北、华北、华东、中南四大地区,11个城市均有产NDM耐药菌,其中北京、上海、海口、厦门等一线和沿海城市阳性菌株数量较多、阳性率较高,且产NDM耐药菌在医院污水中广泛存在。3)人群分布及标本来源分布特点:产NDM耐药菌患者来源中,男性显著多于女性,年龄低于10岁的儿童及大于60岁的老人显著多于其他年龄段患者,推测男性儿童和老年人是感染产NDM耐药菌的易感人群;呼吸内科是blaNDM基因阳性菌检出最多的科室,痰液标本显著多于粪便、血液和尿液等其他标本,推测相比其他传播方式,产NDM耐药菌更易通过呼吸道感染和扩散。4)基因型别特点:本研究发现blaNDM的四种基因型,包括blaNDM-1、blaNDM-3、blaNDM-5和bla NDM-13。产NDM-1耐药菌最多,产NDM-5耐药菌次之,NDM-5为第二优势型别,且在北京、沈阳、海口、济南、上海等多个城市均有发现,提示携带blaNDM-5基因菌株也已在中国广泛传播流行。5)菌属类别特点:产NDM耐药菌中,不动杆菌属细菌数量最多,其次是肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌,近年来产NDM肺炎克雷伯氏菌和产NDM大肠埃希氏菌已在中国部分地区流行。首次发现1株产NDM-3耐药大肠埃希氏菌和1株携带blaNDM-13基因肠炎沙门氏菌,且产NDM-1、NDM-3、NDM-5、NDM-13耐药菌已蔓延至肠道病原菌。2.利用ANI分析可成功鉴定不动杆菌属菌种。首次利用ANI分析方法对产NDM耐药不动杆菌属细菌进行菌种鉴定,38株产NDM耐药不动杆菌属细菌中,有5株托尼尔氏不动杆菌被16S rRNA误鉴定为其他菌种,其中3株被鉴定为鲍氏不动杆菌,1株琼氏不动杆菌和1株约氏不动杆菌。3.cgMLST对产NDM耐药菌属内菌株亲缘关系研究具有重要意义。cgMLST聚类分析发现,产NDM肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌可能已在不同地区的人群中传播,且产NDM托尼尔氏不动杆菌和产NDM乙酸钙不动杆菌可能已在不同地区、不同来源中播散。本研究建立产NDM耐药菌亲缘关系研究的cgMLST实验方法,为产NDM耐药菌监测技术平台和分子分型数据库建立打下了坚实基础。4.中国部分地区产NDM耐药菌耐药谱广,且不同型别、不同菌属耐药谱存在差异。1)产NDM耐药菌都是多重耐药菌,多为泛耐药菌,耐药谱广:77株产NDM耐药菌均对3类以上抗生素耐药,为多重耐药菌。所有菌株对氨苄西林、头孢唑林和头孢曲松的耐药率都高达100%,对头孢他啶和头孢吡肟两种抗菌药物的耐药率都达到了98.7%,对哌拉西林亦是高水平耐药,耐药率为93.5%,对氨曲南的耐药率高达97.4%;所有菌株对碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南、硝基呋喃类的呋喃妥英、磺胺类的复方新诺明均表现高水平耐药,只对氨基糖苷类的阿米卡星较为敏感,但耐药率仍为24.7%。2)产NDM-5菌株耐药性高于产NDM-1耐药菌:对不同型别产NDM耐药菌的耐药性进行比较,发现产NDM-5菌株的耐药率显著高于产NDM-1菌株的耐药率。3)不同菌属产NDM耐药菌耐药谱不同:对不同菌属产NDM耐药菌的耐药性进行比较,发现不同菌属产NDM耐药菌耐药谱不同,不动杆菌属细菌对哌拉西林的耐药率显著低于其他菌属,沙门氏菌属细菌对阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星均敏感,柠檬酸杆菌属细菌仅对四环素敏感;埃希氏菌属细菌仅对阿米卡星表现低水平耐药。提示,产NDM耐药菌感染治疗与防控过程中,抗菌药物的适当调整与合理应用尤为重要。5.相比不动杆菌,携带blaNDM基因的质粒易在肠杆菌科细菌中传播,且耐药性更强。1)blaNDM基因多通过质粒在细菌属内及属间传播:77株产NDM耐药菌株的blaNDM-1基因进行定位分析发现,所有菌株都含有2-5个质粒,67株blaNDM基因定位于质粒上,10株blaNDM基因在染色体上。定位于30~50kb大小质粒菌株最多,涵盖多个菌种,可能有优势质粒在肠杆菌科细菌及不动杆菌属细菌间传播。11株菌2个质粒同时含有blaNDM基因,耐药谱相比其他产NDM耐药菌较广,推测多个含耐药基因质粒可能增强了菌株的耐药性。耐药基因在染色体上的产NDM耐药菌多为不动杆菌属细菌。2)肠杆菌科细菌比不动杆菌的blaNDM基因更易发生水平转移:67株blaNDM基因定位于质粒的产NDM耐药菌进行接合转移实验,49株成功将含blaNDM基因质粒转移至受体菌J53中,未发生接合转移菌株中,18株均为不动杆菌属细菌。3)肠杆菌科细菌blaNDM阳性接合子耐药性强于不动杆菌:对含blaNDM-1基因阳性接合菌耐药情况进行评估发现,所有肠杆菌科菌株具备原始供体菌典型的耐药性,均对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素表现出耐药,而多数不动菌属细菌含blaNDM-1基因接合子虽获得了质粒,但却没有获得相应对碳青霉烯类抗菌药物的耐药表型,仅对头孢菌素类表现为耐药,不具备原始供体菌典型的耐药性。6.似Tn125转座结构在blaNDM基因传播过程中起着重要作用,中国存在产NDM耐药菌引发严重公共卫生问题风险。1)blaNDM基因通过似Tn125转座结构,在细菌属内及属间传播:选取17株不同菌属、blaNDM-1基因不同位置(质粒及染色体)代表菌株,利用菌株二代全基因组测序方法,对其blaNDM-1基因周边结构进行分析发现,17株产NDM耐药菌分7种不同型别似Tn125转座结构,均与pNDM-BJ01的完整Tn125结构不同。2)ISAba125转座酶不是blaNDM基因传播的必需酶:首次发现2株Tn125上下游ISAba125转座酶同时发生丢失的菌株,分别为鲁氏不动杆菌和托尼尔氏不动杆菌;之前报道在blaNDM-1基因传播过程中发挥重要作用的ISAba125转座酶发生丢失,由此推断,ISAba125转座酶不是blaNDM基因传播的必需酶。3)中国携带blaNDM基因菌株源于不动杆菌:结合上述研究和国内外相关报道,及blaNDM-1基因定位于染色体多为不动杆菌属细菌这一现象,推测blaNDM-1基因在中国最早来源于不动杆菌,blaNDM-1基因多嵌合于不动杆菌属细菌染色体上,Tn125或似Tn125转座结构在介导blaNDM-1在不动杆菌属细菌属内传播的同时,转移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙门氏菌等肠杆菌科细菌中。4)中国存在产NDM耐药菌引发严重公共卫生问题风险:结合接合转移及阳性接合子耐药实验发现,不动杆菌的blaNDM-1基因相比肠杆菌科细菌,不易通过基因水平转移至其他菌株,这可能也是中国到目前为止,未发生产NDM耐药菌引发严重公共卫生问题的原因。但肠杆菌科细菌的blaNDM-1基因基本都位于质粒上,且接合转移后对碳青霉烯类高水平耐药。随着产NDM肠杆菌科细菌逐年增多,中国有产NDM耐药菌引发严重公共卫生问题的风险,而blaNDM基因传播过程所需关键调控因子有待深入研究。综上所述,本研究通过细菌耐药监测研究,获得产NDM耐药菌感染发生率和耐药现状,发现不同型别、不同菌属产NDM耐药菌在中国部分地区流行播散;我国产NDM耐药菌耐药谱广,且不同型别、不同菌属耐药谱存在差异,这些结果为临床治疗产NDM耐药菌引起的重症感染,制订科学、有效的预防和控制措施提供了重要的实验依据。进一步对中国部分地区产NDM耐药细菌进行遗传多态性、基因定位及转移特性、blaNDM基因周边结构等研究,初步阐明了blaNDM-1基因在中国最早来源于不动杆菌,在属内传播的同时,转移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙门氏菌等肠杆菌科细菌中。而产NDM耐药肠杆菌科细菌比产NDM耐药不动杆菌的blaNDM基因更易发生基因水平转移,且转移后具备供体菌典型的碳青霉烯类抗菌药物耐药性。随着被报道产NDM肠杆菌科细菌数目逐年增加,推测中国存在产NDM耐药菌引发严重公共卫生问题的风险。因此,提高对产NDM耐药菌的检测、监测和感染控制意识,加强对中国产NDM耐药菌的流行病学监测,警惕其流行变迁、毒力和耐药的变化,对于科学防控产NDM耐药菌感染性疾病在中国甚至全世界的广泛传播有重要意义。