大肠杆菌全局调控因子工程及多西环素与甲砜霉素耐受性研究

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抗生素的过度使用造成细菌的抗生素耐受性,导致了严重的临床治疗问题与环境污染,细菌抗生素耐受性成为了研究的热点。本课题以野生型大肠杆菌为研究对象,基于CRISPR可追踪基因组工程(CREATE)实现全局调控因子突变,经筛选富集得到分别耐受多西环素和甲砜霉素的优势菌群,通过高通量测序与适应度分数计算,获得分别耐受多西环素和甲砜霉素的潜在重要调控因子突变,进一步利用CRISPR技术重构突变菌株,考察不同突变对大肠杆菌耐受多西环素和甲砜霉素的影响,探讨全局调控因子突变对大肠杆菌耐受多西环素和甲砜霉素的遗传机制。全局调控因子突变与抗生素耐受性菌群的筛选以实验室构建的包含20个全局调控因子的突变库为基础,利用CREATE技术实现大肠杆菌全局调控因子突变,分别在多西环素和甲砜霉素胁迫下筛选,获得分别耐受多西环素和甲砜霉素的大肠杆菌重组菌群。全局调控因子突变的重构与验证分析基于深度测序与适应度分数计算,得到6个潜在正向突变,通过CRISPR技术在大肠杆菌MG1655中进行突变重构及其抗生素耐受性分析,结果发现耐受多西环素的正向突变包括:SoxR(G121K)、SoxR(I120E)、SoxR(G121N)、SoxR(G121P);耐受甲砜霉素的正向突变为SoxR(I120E)。突变重构菌株MGZ2(SoxRI120E)、MGZ3(SoxRG121N)、MGZ4(SoxRG121P)表现出抗生素多重耐药性。关键正向全局调控因子突变引起抗生素耐受性的遗传机制分析对于鉴定的正向突变,结合蛋白质模拟分析和RT-PCR,探讨突变引起抗生素耐受性的遗传机制。调控因子SoxR在120位、121位的突变位于蛋白活性中心[2Fe-2S]附近,SoxR首先激活soxS的表达,然后通过激活soxS的表达从而进一步调控下游相关基因的表达,通过这一调控网络的作用来响应外界抗生素胁迫,引起大肠杆菌多西环素和甲砜霉素耐受性的提高。RT-PCR实验结果表明,SoxR突变重构菌株MGZ1(G121K)、MGZ2(I120E)、MGZ3(G121N)、MGZ4(G121P)中,外排相关蛋白基因acrZ、外排转运蛋白基因acrB、膜蛋白相关基因ompN、多重耐药相关基因marB转录水平上调。推测调控因子突变通过上调药物外排泵、降低膜通透性等方式协同作用提高大肠杆菌对抗生素的耐受性。
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