背景局部麻醉药(local anaesthetics, LAs)是临床实施局部麻醉和镇痛的常用药。然而,越来越多的报道显示,LAs在减轻患者术后疼痛、促进机体功能恢复的同时,还存在潜在的骨骼肌毒性。局部持续注射LAs可引起周围骨骼肌损伤,包括医源性肌肉疼痛、功能障碍和肌肉变性。虽然对LAs潜在肌毒性的研究已有50多年,但LAs导致骨骼肌毒性的具体机制仍未被全面了解。因此,深入探讨LAs引起肌毒性的具体机制有助于发现防治LAs副作用的新方法。自噬是一种进化上高度保守的的代谢过程,它可将细胞内成分如受损的蛋白和细胞器,通过溶酶体依赖途径降解。所以自噬对维持细胞内稳态至关重要。哺乳动物中的自噬可分为三种：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬(即本文所指的自噬)可分为自噬体形成、自噬体成熟、自噬体降解三个阶段。自噬体形成阶段指膜结构包裹需要降解细胞成分；自噬体成熟和降解阶段指自噬体与溶酶体融合形成白噬溶酶体,继而降解其内容物。有研究表明阻断自噬流可直接导致细胞死亡或增加细胞对损伤性刺激的敏感性。近期一些研究表明,自噬现象也出现在LAs损伤的肌细胞中。Morisette等人发现布比卡因和利多卡因可引起平滑肌坏死、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ增加和自噬体融合蛋白GFP-LC3曾多。Peropadre等人也提出二丁卡因可引起肌细胞内自噬体聚集。这些研究都提示LAs可引起肌细胞内自噬体增加,自噬参与了LAs引起的肌毒性。那么自噬在LAs肌毒性中的作用及机制是什么呢?目的探讨自噬在局麻药布比卡因肌毒性中的作用及机制。内容与方法一、布比卡因引起肌毒性和自噬体增加1.布比卡因引起肌毒性采用MTT法测定不同浓度布比卡因对细胞存活的影响,选择合适的布比卡因浓度作为实验模型。通过LIVE/DEAD染色法测定细胞死亡率。于相差倒置显微镜(200×)下观察细胞的形态和生长状态改变。伊红染色观察小鼠腓肠肌组织学变化。2.布比卡因促进自噬标志物和自噬体形成共聚焦显微镜下观察EGFP-LC3融合蛋白表达情况,Western blot法检测LC3-Ⅱ蛋白水平,透射电镜下观察自噬体结构。二、布比卡因引起自噬体增加的机制1.自噬活性检测Western blot法检测p-Akt, p-p70S6K和p-mTOR蛋白水平2.自噬体清除检测Western blot法检测p62蛋白水平3.溶酶体功能检测LysoTracker Red DND-99(溶酶体探针)染色检测溶酶体数量,LysoSensor Yellow/Blue DND-160(溶酶体染料)染色检测溶酶体腔PH值的变化,Cathepsin-B活性检测试剂盒检测溶酶体酶Cathepsin-B的活性。Western blot法检测LAMP-1蛋白水平4.自噬体与溶酶体融合检测采用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染检测EGFP-LC3和溶酶体共域化程度三、自噬体与溶酶体融合障碍导致布比卡因的肌毒性1.自噬激动剂雷帕霉素促进自噬体清除,减轻布比卡因引起的细胞损伤采用自噬激动剂雷帕霉素预处理后,Western blot法检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平,采用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染检测EGFP-LC3和溶酶体共域化程度,通过LIVE/DEAD染色法测定细胞死亡率。于相差倒置显微镜(200×)下观察细胞的形态和生长状态改变。2.自噬相关基因Atg5的敲降抑制自噬进程,加重布比卡因引起的细胞损伤Atg5 siRNA转染预处理后,采用实时定量聚合酶链反应法检测Atg5 mRNA水平,采用Western blot法检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平,采用MTT法测定细胞存活率。3.自噬抑制剂氯喹抑制自噬流,加重布比卡因引起的细胞损伤采用Western blot法检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62蛋白水平,采用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染检测EGFP-LC3和溶酶体共域化程度,采用MTT法测定细胞存活率。通过LIVE/DEAD染色法测定细胞死亡率。于相差倒置显微镜(200×)下观察细胞的形态和生长状态改变。结果一、布比卡因引起肌毒性和自噬体的增加1.布比卡因引起肌毒性1.1不同浓度布比卡因对细胞存活的影响终浓度为100μM、300μM、600μM、900μM、1200μM的布比卡因作用24hr后,结果显示：与对照组相比,100μM对细胞增殖无明显的抑制作用,然而后四种浓度的细胞增殖抑制率分别为16.0%,49.0%,65.0%和76.8%,且抑制率随布比卡因浓度的增加而逐渐增加俨<0.01)。1.2布比卡因引起细胞形态学损伤布比卡因(600μM)处理24hr后,于相差倒置显微镜(200×)下观察细胞的形态和生长状态改变。结果显示：与对照组相比,布比卡因组细胞皱缩,细胞间间隙变大,细胞形态完整性消失。1.3布比卡因增加细胞死亡率布比卡因(600μM)作用36hr后,用LIVE/DEAD染色法测定细胞死亡率结果显示：与对照组相比,布比卡因组死细胞数占总细胞数的百分比增加了18倍(P<0.01)。1.4布比卡因注射小鼠腓肠肌引起局部肌肉损伤0.5%,20μl的布比卡因注射小鼠腓肠肌,72hr后收集骨骼肌组织,经石蜡包埋切片后,进行HE染色。结果显示：对照组(生理盐水组)仅有轻微的水肿和炎性细胞浸润。布比卡因组肌细胞间质水肿显著,肌纤维溶解断裂,细胞核消失,组织间质中有大量的炎性细胞浸润。2.布比卡因促进自噬标志物和自噬体形成2.1布比卡因促进C2c12细胞EGFP-LC3融合蛋白表达增加EGFP-LC3质粒转染后,布比卡因(600μM)作用6hr。结果显示：与对照组相比,自噬体的标志物EGFP-LC3融合蛋白表达增加转位至自噬体膜增多,在共聚焦显微镜下形成的明亮的绿色荧光亮点数量是对照组的34倍(P<0.01)。2.2布比卡因促进C2c12细胞白噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达增加布比卡因(600μM)作用6hr后,Western blot法检测显示：与对照组相比,布比卡因组胞浆型LC3-Ⅰ转变为膜型LC3-Ⅱ(自噬标志蛋白)增多,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是对照组的5.5倍(P<0.01)。2.3布比卡因促进肌组织内自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达增加0.5%,20μ1的布比卡因注射小鼠腓肠肌18hr后,应用Western blot法检测发现：与对照组(生理盐水组)相比,布比卡因组胞浆型LC3-Ⅰ转变为膜型LC3-Ⅱ(自噬标志蛋白)增多,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是对照组的4.3倍(P<0.01)。2.4布比卡因促进C2c12细胞内自噬小体形成布比卡因(600μM)作用6hr后,透射电镜下观察发现：与对照组相比,布比卡因组内含各种多余或衰老细胞器的、成双层膜的液泡状结构的自噬体增多,数量是对照组的5.6倍(P<0.01)。2.5布比卡因促进肌组织内自噬小体形成0.5%,20μl的布比卡因注射小鼠腓肠肌18hr后,透射电镜下观察发现：对照组(生理盐水组)肌组织中几乎未见自噬体样微结构,而布比卡因组肌组织内含各种多余或衰老细胞器的、成双层膜液泡状结构的自噬体明显增多。二、布比卡因引起自噬体增加的机制1.布比卡因抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路,激活自噬布比卡因(600μM)作用6hr后,Western blot法检测发现：布比卡因组p-Akt,p-p70S6K和p-mTOR蛋白水平较对照组相比明显降低46.9%,36.4%和46.6%(P<0.01)。2.布比卡因增加p62蛋白水平2.1布比卡因增加C2c12细胞p62蛋白水平布比卡因(600μM)作用6hr后,Western blot法检测发现：布比卡因组p62蛋白水平较对照组相比明显增加29.1%(P<0.01)。2.2布比卡因增加小鼠骨骼肌内p62蛋白水平0.5%,20μ1的布比卡因注射小鼠腓肠肌18hr后,收集肌组织,应用Western blot法检测p62蛋白水平。结果显示：布比卡因组处理18hr后,与生理盐水组相比,布比卡因组p62蛋白水平明显增加91.6%(P<0.01)3.布比卡因没有通过抑制溶酶体的活性来减少自噬体的清除3.1布比卡因增加胞内溶酶体的数量布比卡因(600μM)作用6hr后,LysoTracker Red DND-99(溶酶体探针)染色发现：布比卡因组溶酶体数量较对照组相比增加15.2%(P<0.01)。3.2布比卡因没有通过碱化溶酶体腔来抑制溶酶体功能布比卡因(600μM)作用6hr后, LysoSensor Yellow/Blue DND-160(溶酶体染料)染色发现：与对照组相比,阴性参照氯喹组,酸性溶酶体腔被碱化,溶酶体功能障碍,代表活性溶酶体的明亮的绿色荧光亮点几乎没有。而布比卡因组的明亮的绿色荧光亮点数较对照组相比无减少。3.3布比卡因增加溶酶体酶Cathepsin B活性布比卡因(600μM)作用6hr后,Cathepsin-B活性检测试剂盒染色发现：与对照组相比,布比卡因组的cathepsin B舌性增高23.7%(P<0.01)。3.4布比卡因增加LAMP-1蛋白水平布比卡因(600μM)作用6hr后, Western blot法检测发现：布比卡因组LAMP-1蛋白水平较对照组相比明显增加34.6%(P<0.01)。4.布比卡因阻碍自噬体与溶酶体的融合,导致了自噬体的清除障碍布比卡因(600μM)作用6hr后,采用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染发现：与对照组相比,布比卡因组EGFP-LC3和溶酶体共域化(黄色荧光)比例显著减少67.0%(P<0.01)。三、自噬体与溶酶体融合障碍导致布比卡因的肌毒性1.自噬激动剂雷帕霉素促进自噬体清除,减轻布比卡因引起的细胞损伤1.1雷帕霉素激活自噬,增加LC3-Ⅱ蛋白水平的同时减少p62蛋白的聚集雷帕霉素(500nM)预处理30min后,加入布比卡因(600μM)作用6hr, Western blot法检测发现：与布比卡因组比较,雷帕霉素+布比卡因组的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加60.8%(P<0.01),雷帕霉素+布比卡因组的p62蛋白水平降低57.6%(P<0.01)。结果同时显示,与对照组比较,雷帕霉素组的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著增加,p62蛋白水平显著降低(P<0.01)。1.2雷帕霉素促进自噬体与溶酶体的融合雷帕霉素(500nM)预处理30min后,加入布比卡因(600μM)作用6hr,应用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染发现：与布比卡因组比较,雷帕霉素+布比卡因组的EGFP-LC3和溶酶体共域化部分(黄色荧光)所占比例显著增加312.5%(P<0.01)。1.3雷帕霉素显著降低布比卡因引起的C2c12细胞死亡率雷帕霉素(500nM)预处理30min后,加入布比卡因(600μM)作用36hr,采用LIVE/DEAD染色发现：与布比卡因组比较,雷帕霉素+布比卡因组使细胞死亡率降低48.6%(P<0.01)。结果同时显示,与对照组比较,雷帕霉素组不引起明显细胞死亡1.4雷帕霉素显著减轻布比卡因引起的C2c12细胞形态学损伤雷帕霉素(500nM)预处理30min后,加入布比卡因(600μM)作用24hr,相差倒置显微镜下观察发现：雷帕霉素+布比卡因组显著减轻布比卡因诱导的C2c12细胞形态损伤,布比卡因未处理前,细胞呈规则的梭形或多边形,有立体感。布比卡因处理后,细胞皱缩,细胞间间隙变大,细胞形态完整性消失,而雷帕霉素+布比卡因组的细胞形态学变化较布比卡因组显著减轻。雷帕霉素单独处理组细胞形态较对照组没有明显改变。2.自噬相关基因Atg5的敲降抑制自噬进程,加重布比卡因引起的细胞损伤2.1 Atg5基因敲降后,胞内自噬相关基因水平下降Atg5 siRNA转染24hr后,采用实时定量聚合酶链反应法检测发现：与阴性对照组比较,Atg5 siRNA组的Atg5 mRNA水平降低83.8%(P<0.01)。2.2 Atg5基因敲降后,胞内自噬相关蛋白水平发生变化Atg5 siRNA转染48hr后,采用Western blot法检测发现：与阴性对照组比较,Atg5 siRNA组的Atg5蛋白水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值分别降低了91.1%和80.8%；结果同时显示：与阴性对照组比较,Atg5 siRNA组的p62蛋白水平增加了144.2%(P<0.01)。2.3 Atg5基因敲降显著加重布比卡因引起的细胞增殖抑制Atg5 siRNA转染48hr后,加入布比卡因(600μM)作用24hr,采用MTT法检测。结果显示：与布比卡因组比较,siRNA+布比卡因组使细胞增殖活性降低26.4%(P<0.01)。3.自噬抑制剂氯喹抑制自噬流,加重布比卡因引起的细胞损伤3.1氯喹增加LC3-Ⅱ蛋白水平布比卡因作用6hr后,收集细胞,应用Western blot法检测对照组、氯喹组、布比卡因组和氯喹+布比卡因组的LC3-Ⅱ和p62蛋白水平。结果显示：与布比卡因组比较,氯喹+布比卡因组的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加了1.4倍(P<0.01)；与对照组比较,氯喹组的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加了4.3倍(P<0.01)；结果同时显示：与布比卡因组比较,氯喹+布比卡因组的p62蛋白水平增加了10.5%。3.2氯喹抑制溶酶体活性,加重自噬体与溶酶体的融合障碍EGFP-LC3质粒转染C2c12细胞后,应用EGFP-LC3和Lyso Tracker荧光双染技术对布比卡因组和氯喹+布比卡因组的自噬体标志物EGFP-LC3(绿色荧光)和溶酶体(红色荧光)进行共域化分析。结果显示：与布比卡因组比较,氯喹+布比卡因组的EGFP-LC3和溶酶体共域化部分(黄色荧光)所占比例显著减少,并且自噬体体积增大。3.3氯喹加重布比卡因引起的C2c12细胞增殖抑制氯喹(10μM)预处理30min后,加入布比卡因(600μM)作用24hr,采用MTT法检测细胞增殖活性。结果显示：与布比卡因组比较,氯喹+布比卡因组使细胞增殖活性降低24.3%(P<0.01)。3.4氯喹加重布比卡因引起的C2c12细胞形态学损伤于相差倒置显微镜(200×)下观察细胞的形态和生长状态改变。结果显示：氯喹+布比卡因组显著加重布比卡因诱导的C2c12细胞形态损伤,布比卡因未处理前,细胞呈规则的梭形或多边形,有立体感。布比卡因处理后,细胞皱缩,细胞间间隙变大,细胞形态完整性消失,而氯喹+布比卡因组的细胞形态学损伤较布比卡因组显著加重。氯喹单独处理组细胞形态较对照组无明显改变.3.5氯喹增加布比卡因引起的C2c12细胞死亡率同上采用LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒染色,检测对照组、氯喹组、布比卡因组和氯喹+布比卡因组的细胞死亡率。结果显示：与布比卡因组比较,氯喹+布比卡因组细胞死亡率增加20.3%(P<0.01)。结果同时显示,与对照组比较,氯喹组不引起明显细胞死亡结论布比卡因处理后,肌细胞作出应激反应会促进胞内自噬体形成增加,然而,自噬体与溶酶体融合障碍又抑制了自噬体的清除。所以,自噬体清除受损可能是布比卡因引起肌毒性的一个新机制。