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目的：本课题研究内容分为两大部分。第一部分；主要探讨与优化传统核酸适配体(Aptamers)的筛选方法(如Protein-SELEX和Cell-SELEX),拟高速(high speed)筛选具有高亲和性的靶向CD33蛋白核酸适配体,并研究其结构对其亲和性与稳定性的影响。第二部分；主要以抗肿瘤药物阿霉素(Dox)及不同形态的linker为研究对象,合成核酸适配体(Aptamers)与抗肿瘤药物偶联物(ADCs),对比两种释放阿霉素(Dox)方式(即二硫键断裂和亚胺水解释放Dox)对抗肿瘤作用的影响,以确定适合用来游离目标物的结合方式。方法：第一部分,本研究以Protein-SELEX筛选为基础,主要以重组CD33抗原蛋白为靶向蛋白,筛选出与CD33特异性结合的核酸适配体(Aptamers)。其次,在Cell-SELEX筛选基础上,我们进一步优化筛选条件,缩短筛选时间和提高亲和力。研究通过以HEK-293T细胞表达CD33蛋白为CD33~+阳性细胞,HEK-293T细胞为CD33~-阴性细胞,依次优化和探索核酸适配体的筛选效率及亲和性。斑点杂交法主要用于检测筛选所得的DNA配基与CD33蛋白分子的亲和性；Western Blot及免疫荧光法用于验证细胞中CD33蛋白的表达及膜细胞定位状况；流式细胞术法检测每轮筛选后所得的DNA配基与CD33~+阳性细胞(如HL60或CD33~+过表达HEK-293T细胞)的结合能力。计算机模拟分子间对接(Docking)方法用于计算并模拟CD33蛋白与核酸适配体的三维结构。第二部分,探讨偶联药物与适配体的合成及条件摸索,解决药物与适配体之间的间接化合物SPDP (Linker)最佳反应条件；如以SPDP或SPDP-hydrazine连接抗肿瘤药物阿霉素(Dox)的反应基团酰胺键和碳氮双键,经HPLC、LC-MS和~1HNMR检测,确认Dox与SPDP~Ⅰ及SPDP~Ⅱ是否成功连接为Dox-SPDP~Ⅰ与Dox-SPDP~Ⅱ的形态；MTT与流式细胞术检测Dox-SPDP~Ⅰ 及 Dox-SPDP~Ⅱ的抗肿瘤作用,判别抗肿瘤药物Dox连接Linker。结果：第一部分,基于经典的Protein-SELEX方法,我们筛选得到能够特异性结合CD33阳性细胞的核酸适配体A88(耗时近半年)。然而,我们优化的传统核酸适配体Cell-SELEX筛选方法即Smart Cell-SELEX筛选得到核酸适配体S30(耗时9小时),并且稳定性高于经典Protein-SELEX方法筛选出的适配体,解离平衡常数Kd值均较小。流式细胞术,Western Blot和免疫荧光结果显示,Smart Cell-SELEX筛选得到核酸适配体S30特异性结合CD33阳性细胞,而且S30的进一步剪切体C2和NC2能够结合CD33抗原。第二部分：HPLC、~1HNMR和LC-MS结果显示,抗肿瘤药物Dox与Linker即SPDP~Ⅰ与SPDP~Ⅱ成功连接,形成Dox-SPDP~Ⅰ与Dox-SPDP~Ⅱ复合体。MTT与流式细胞术结果显示,Dox-SPDP~Ⅰ的抗肿瘤作用明显降低,而Dox-SPDP~Ⅱ略有降低,提示药物连接Linker会对药物本身的活性有影响。结论：第一部分：与传统筛选技术相比,新的Smart Cell-SELEX筛选技术可以将筛选时间缩短数十倍,在有效去除非特异性结合的DNA配基的基础上快速筛选出亲和性极高的核酸适配体。核酸适配体的亲和性与其结构中的特殊结构有关,但其稳定性则由整个序列决定。第二部分：与运用酰胺键连接的Dox-SPDP~Ⅰ相比,以碳氮双键偶联合成的Dox-SPDP~Ⅱ在体内更易降解并游离出Dox,且Dox糖基上的氨基可能为其活性基团。