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细胞色素P450芳香化酶（Aromatase cytochrome P450,P450arom）由cyp19a1基因编码,是催化雄激素转化为雌激素的关键酶。研究发现,cyp19a1基因不仅在鱼类的性别决定中发挥着关键性的作用,还参与调节鱼类的生长发育。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是我国常见的小型经济鱼类,野生泥鳅中不仅有二倍体,在长江流域还有大量的四倍体。与二倍体相比,四倍体泥鳅生长快、个体大,具有显著的生长优势,但其性腺发育较为滞后,即在相同的养殖环境下,二倍体泥鳅1龄即可性成熟并开始繁殖活动,而四倍体泥鳅要2龄以后才能达到性成熟。此外,无论是二倍体还是四倍体,雌性泥鳅的生长及体型均优于雄性,表现出明显的性别二态性。为研究cyp19a1基因的表达与这些生物学性状差异的相关性,本研究克隆了泥鳅cyp19a1基因的全长c DNA和启动子序列;比较cyp19a1在不同发育阶段、雌雄个体间的表达差异,及其与dnmts表达水平的相关性,分析在相应发育阶段中血液雌二醇和睾酮水平的变化特征;研究cyp19a1基因的表达水平与DNA甲基化水平的相关性。构建了泥鳅cyp19a1a和cyp19a1b的敲除品系F0代,为研究cyp19a1a和cyp19a1b的功能准备实验鱼材料。主要研究结果如下:1.泥鳅cyp19a1全长c DNA和启动子序列克隆及分析1)泥鳅cyp19a1a的c DNA序列长度为1905 bp,包括29 bp的5’UTR、301 bp的3’UTR和1575 bp的ORF序列,编码524个氨基酸;其编码氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hi TAIL-PCR技术克隆获得了2040bp的启动子序列,在该序列上预测到典型功能元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。2)泥鳅cyp19a1b的c DNA序列长度为1666 bp,包括39 bp的5’UTR、124 bp的3’UTR和1503 bp的ORF序列,编码500个氨基酸;其氨基酸序列中存在P450蛋白结构域、跨膜结构域、卷曲螺旋结构域、RL11结构域和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,c端结构域等。克隆得到1800 bp的启动子序列,在该序列上预测到典型功能元件TATA-box,以及Ftz、SRF、SP1、GR、PR、Myo D、SOX-9、SOX-4、E2和ER等转录因子结合位点。2.Cyp19a1基因在泥鳅性别和倍性间的表达比较1)以二倍体泥鳅为对象,取性腺发育典型时期的脑、性腺、肝脏、肌肉和血液,比较cyp19a1基因在不同发育阶段、及其雌雄个体间的表达差异。结果显示,cyp19a1a在卵巢中的表达水平最高,显著高于精巢（P<0.05）,而在脑中的表达水平最低。在卵巢发育的第II、III期,cyp19a1a表达水平较高,在IV期表达水平急剧下降,在第V期达到最低;在精巢中,cyp19a1a随性腺发育呈递减趋势。Cyp19a1b在脑中的表达水平显著高于性腺（P<0.05）,且在雌鳅脑中的表达水平高于雄鳅（P<0.05）;在第II、III期,cyp19a1b在雌鳅脑中的表达水平较低,但在第IV、V时期的表达水平显著升高（P<0.05）;在各个发育阶段中,精巢cyp19a1b的表达水平均高于卵巢。2)泥鳅血液中雌二醇（E2）和睾酮（T）的浓度变化与其发育阶段相关。血液E2水平在性腺发育的第III期最高,且雌鳅血液的E2水平始终高于雄鳅;雌鳅和雄鳅血液T的浓度均在第IV期最高,呈现先升高后降低的特点,并且雌鳅血液T的浓度始终低于雄鳅。此外,分析发现,E2和T的浓度变化分别与性腺中cyp19a1a和cyp19a1b的表达水平变化趋势一致。3)以12月龄的二、四倍体泥鳅为对象,分析cyp19a1在泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体（除精巢外）;cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达水平显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达水平显著低于二倍体（P<0.05）,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关。3.Cyp19a1的甲基化水平变化及其与基因表达的相关性分析1)在性腺发育的各个时期,cyp19a1a基因在精巢中始终处于高甲基化水平,且在精巢中的平均甲基化水平均高于卵巢;随着性腺的发育,cyp19a1a在卵巢中的甲基化水平呈现出先下降后上升的特点。相关性分析发现,cyp19a1a基因的表达水平和甲基化水平呈显著的负相关（R~2=0.81）,表明DNA甲基化可能参与了调控cyp19a1a在性腺中的表达,进而影响泥鳅的性别分化和性腺发育。2)Cyp19a1b基因的甲基化水平在雌雄泥鳅间没有显著性差异,且在性腺发育的各个时期的变化也不明显,甲基化水平均在60%-80%之间。相关性分析发现,cyp19a1b基因的平均甲基化水平与其表达水平没有显著的相关性（R~2=0.19）。3)DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（dnmts）催化和维持的,因此,本研究进一步分析了cyp19a1的表达水平与dnmts表达水平的相关性。结果显示,dnmt1、dnmt3aa和dnmt3b与cyp19a1a的表达均没有明显的相关性;但dnmt3ab与cyp19a1a的表达水平呈显著负相关（r=-0.535,P=0.007）,且与cyp19a1a的甲基化水平呈显著正相关（r=0.773,P=0.025）,推测dnmt3ab可能通过调节性腺cyp19a1a的甲基化水平,进而影响cyp19a1a基因的表达。将dnmts的表达水平与cyp19a1b的表达水平进行相关性分析发现,dnmts的表达水平与cyp19a1b的表达水平没有显著的相关性,但dnmt3b与cyp19a1b的甲基化水平呈显著正相关（r=0.899,P=0.002）。