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蛋白C（protein C，PC）是机体抗血栓形成的主要血液凝固调节物质，属于维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶原，主要在肝脏合成，由一条轻链与一条重链经二硫键连接而成，相对分子质量为62kDa。其合成后，在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的催化下，剪切掉一段长12肽的激活肽段后，转变为活化蛋白C（activated protein C，APC）。APC与其辅因子蛋白S（protein S，PS）结合，在钙离子和磷脂存在的条件下，主要通过灭活活化的凝血因子Ⅴ（active coagulation factor，FⅤa）和活化的凝血因子Ⅷ（active coagulation factor，FⅧa）起到抗凝作用。遗传性蛋白C缺陷症是由合成该蛋白的基因突变所致，通常呈常染色体隐性或不完全显性遗传，对患者及其后代影响很大。近年来，血栓性疾病的发病率逐年增长并严重影响到人类生命健康。对这类疾病家系进行实验室表型诊断和基因分析则有助于阐明该类疾病的发病机制，从而对这类疾病的早期预防、临床治疗甚至产前筛查等提供理论依据。本研究对一个遗传性蛋白C缺陷症家系进行实验室表型诊断与基因分析，初步探讨其分子致病机制。 目的: 通过对一个遗传性蛋白C缺陷症家系进行实验室表型检测与基因分析，明确患者基因突变类型，同时采用生物信息学相关软件对突变的位点加以分析，探讨其分子致病机制。 方法: 1、病史采集：先证者为8岁男性，因紫癜待查入院，血常规检查血小板数量正常；凝血功能检查结果显示蛋白C活性（protein C activity，PC:A）为30%，蛋白C抗原（protein C antigen，PC:Ag）为35%。家系成员3代共7人，先证者无相关病史及长期用药史，父母非近亲婚配，其他成员均无相关病史。 2、表型检测：采取先证者及其家系成员的静脉血于含有枸橼酸钠的真空采血抗凝管中，离心制得贫血小板血浆（platelet-poor plasma,PPP）在STA-R全自动血凝仪上采用一期凝固法检测凝血酶原时间（prothrombin time,PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶时间（thrombin time,TT）；Clauss法检测纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）含量；采用发色底物法检测PC:A、蛋白S活性（protein S activity,PS:A）及抗凝血酶活性（antithrombin activity,AT:A）；采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测PC:Ag，通过以上检测明确临床表型诊断。 3、基因检测：用基因组DNA提取试剂盒抽提先证者及家系成员外周血单个核细胞基因组DNA。根据蛋白C基因（protein C gene，PROC）序列(GenBank AF378903)，应用primer5软件设计8对引物以覆盖PC基因的所有外显子区域及其侧翼。聚合酶链式反应（polymerse chain reaction,PCR）扩增PC基因全部外显子，5’、3’非编码区及其侧翼序列；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用ABI3730测序仪进行正、反向测序。用Chromas软件将测序结果与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）基因文库的PC基因序列在Blast上进行比对，寻找基因突变位点。先扩增先证者PC基因各外显子及侧翼序列，发现突变位点后再扩增家系其他成员的相应外显子片段。 4、数据分析：用PolyPhen-2软件预测突变位点的危害性，用Clustal X软件对其保守性进行分析；基于已知的PC结构模型，用Swiss-PdbViewer软件构建蛋白空间模型，进一步分析PC蛋白突变前后分子内氨基酸相互作用力的改变。 结果: 1、先证者PC:A为30%，PC:Ag为35%，其父亲、母亲及姑姑的PC:A均略低于参考范围；先证者在 PROC第7外显子存在 c.565 C>T杂合错义突变（p.Arg147Trp），并在第5外显子存在c.383G>A杂合错义突变（p.Gly86Asp）；其父亲和姑姑均携带c.565 C>T杂合突变，母亲携带c.383G>A杂合突变。 2、生物信息学软件 PolyPhen-2分析显示 p.Arg147Trp为良性突变，p.Gly86Asp为有害突变。Clustal X分析显示p.Arg147Trp在同源物种间不保守，而p.Gly86Asp则高度保守。突变蛋白模型分析显示，p.Arg147Trp突变产生的Trp147芳香环破坏了Arg147和Lys146、Lys151的两个氢键，并与Arg178之间产生分子碰撞。p.Gly86Asp突变后Asp86侧链延长，和Gln90侧链之间产生分子碰撞力。基因突变导致的氢键破坏和碰撞作用改变了氨基酸的空间构型，使突变蛋白稳定性下降或分泌障碍。 结论: 1、该先证者PROC第7和第5外显子分别存在p.Arg147Trp和p.Gly86Asp杂合突变。 2、先证者p.Arg147Trp杂合突变遗传自父亲；p.Gly86Asp杂合突变遗传自母亲。 3、复合杂合突变p.Arg147Trp和p.Gly86Asp是导致患者PC水平下降的主要原因。其中p.Gly86Asp国内外鲜见报道。