论文部分内容阅读
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 KZNF家族(ABxZ型)真核表达载体pCMV-Myc-KZNFs的构建与P53的转录因子活性调节子的筛选 目的:构建KZNF家族(ABxZ型)真核表达载体pCMV-Myc-KZNFs,用于筛选KZNF家族中P53调控分子。筛选对于P53转录因子活性有影响的真核表达载体pCMV-Myc-KZNFs,用于深入筛选。 方法:利用试剂盒从多种细胞中提取RNA,并逆转录得到cDNA,利用合成的引物,用PCR的方法合成DNA片段,酶切后连入经过相同酶切的pCMV-Myc载体,测序正确,通过转染并裂解煮沸真核细胞,利用Western Blot检测方法验证质粒表达情况。将pCMV-Myc-KZNFs,RL:CMV,pG13L质粒转染至结肠癌细胞HCT116 P53+/+和HCT116 P53-/-(同时转入外源P53质粒,即pCMV-Flag-P53质粒)中,转染48h后用于报告基因实验,检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光参数的比值,确定P53的转录因子活性在KZNFs过量表达时是否发生显著改变。 结果:成功构建KZNF家族(ABxZ型)中大部分真核表达载体pCMV-Myc-KZNFs(25/28)真核表达载体。结肠癌细胞HCT116 P53+/+,HCT116 P53-/-中,部分外源KZNF蛋白的过量表达,使内源或外源P53转录因子活性发生显著降低,在极小部分KZNF蛋白表达的情况下,内源或外源P53转录因子活性受到明显激活,另外一部分KZNFs的蛋白表达对于内源或外源P53的转录因子活性没有显著影响。 结论:真核细胞中外源KZNF蛋白过量表达的情况下,一部分KZNF家族成员,很可能对于癌细胞中表达的P53的转录活性具有强烈抑制或者激活作用,另一部分则对于P53转录因子活性没有明显的影响。所以不同的KZNF家族成员在P53调控功能上具有差异性。筛选出的对于P53的转录因子活性有显著影响的KZNF分子可以用于进行下一步的筛选工作。 第二部分 筛选与P53有直接结合能力的KZNF家族成员(ABxZ型),明确KZNFs对内外源P53功能选择性调控 目的:筛选与P53有直接结合能力的KZNF家族成员(KRAB ABxZ型),明确KZNFs对内外源P53功能调控的选择性。 方法:利用免疫共沉淀实验验证细胞内转染pCMV-Flag-P53和上一步筛选到的部分外源pCMV-Myc-KZNFs的体内结合能力,筛选出的有能力结合P53的 pCMV-Myc-KZNFs,用于梯度转染人类结肠癌细胞HCT116 P53+/+,HCT116 P53-/-中,在过量表达外源KZNF蛋白的情况下,蛋白质免疫印迹的方法检测P53下游各个靶基因蛋白表达是否受到梯度性的抑制。 结果:HCT116 P53-/-中,外源P53和部分外源KZNF成员存在很强结合能力,另外一部分KZNF蛋白分子与P53蛋白未检测到蛋白质两两相互作用。HCT116 P53+/+, HCT116 P53-/-中内源或外源P53存在下,P53的下游某个或某些特定靶基因的蛋白表达受到了某些KZNF家族成员的特异性抑制。 结论:HCT116 P53+/+,HCT116 P53-/-细胞内的KZNF家族一部分特定成员很可能与P53在结构上存在直接相互作用,并且在这部分可以结合的成员中有一部分成员可以明显选择性抑制P53的凋亡、代谢等功能,很可能属于Apak的亚家族成员。挑选对于P53转录活性具有抑制作用的KZNF蛋白用于进一步筛选和功能研究。