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第一部分系统生物学方法整合分析川崎病相关基因及NFAT信号通路的构建目的:以系统生物学方法整合分析川崎病(Kawasaki disease,KD)相关基因,并构建可能的生物信息通路,进一步探讨KD免疫损害的发生机制。方法:以”Kawasaki disease”“Kawasaki syndrome”“lymph node syndrome”“mucocutaneous lymph node syndrome”和“polymorphism”“gene”“genetic”“allele”“genotype”等为相关检索语言,在Pubmed、Ovid、Google Scholar数据库中检索与KD相关基因的文献,提取有统计学意义的基因。用DAVID软件在基因功能、信息通路等方面对基因进行功能注释;用GeneGo MetaCore进行富集分析并构建生物信息通路;用STRING分析这些基因编码的蛋白之间联系。结果:与川崎病有统计学意义的基因主要涉及KD易感性、冠脉损害、不完全KD、IVIG治疗无反应、KD延迟诊断等,其中候选基因组65个,全基因组关联分析18个。DAVID软件分析显示这些基因的功能主要集中于损伤与防御反应、炎症反应(富集分数=15.91);细胞钙离子平衡稳态、细胞趋化(富集分数=3.75),免疫系统的调节(富集分数=3.58)。GO Process显示基因的功能主要富集于免疫反应、损伤与防御反应、应激反应等,与DAVID显示的基因功能注释相符。GO Disease显示,这些基因参与了皮肤黏膜淋巴结综合征(即KD)、炎症性肠病、皮肤疾病、血管炎性疾病、关节炎等免疫炎症性疾病的病理生理过程。GO Pathway显示,这些基因富集的通路主要集中于免疫反应信号通路,如:HSP60和HSP70/TLF信号通路、炎性反应信号通路、纤维蛋白溶酶信号通路、细胞核活化因子NFAT与白细胞相互作用的信号通路、树突状细胞中组胺信号通路等。除免疫反应信号通路外,同时还有粘附分子信号通路、生长与繁殖信号通路、凋亡与存活信号通路等。STRING显示与KD相关的基因编码的蛋白间密切相连,并构成相互交错的信息网络,其中TNF-α处于网络的中心环节。结论:1.KD有统计学意义的基因间密切关联,形成众多免疫、细胞粘附、增殖、凋亡与存活等信号通路,共同参与了 KD的免疫损伤过程。2.NFAT信号通路在KD的免疫损害过程中发挥了重要的作用。第二部分:川崎病患儿外周血单个核细胞中OX40、OX40L和NFAT的表达及OX40-OX40L对NFAT调控作用目的:分析OX40、OX40L及NFAT在KD急性期的表达及其临床意义,并探讨OX40-OX40L与NFAT间的调控关系。方法:1.选择55例KD患儿,其中冠状动脉损伤者12例,非冠状动脉损害者43例。发热及正常对照组各23例。采用Real-time PCR检测OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2 mRNA的表达,采用westerm blot检测OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2蛋白的表达水平。2.培养正常儿童及KD患儿PBMC,分别以刺激型OX40抗体及抑制型OX40L抗体作用于OX40-OX40L轴后,Real-time PCR和western blot检测细胞中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白的表达。结果:1.KD组急性期治疗前PBMC中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01);KD冠脉损伤组NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表达高于KD无冠脉损害组,但无统计学意义(P>0.01)。KD治疗后NFAT1、NFAT2mRNA及蛋白表明显减少(P<0.01)。2.KD组急性期治疗前PBMC中OX40、OX40L mRNA及蛋白表达显著高于对照组(P<0.01);KD冠脉损伤组OX40、OX40LmRNA及蛋白表达高于KD无冠脉损害组,但无统计学意义(P>0.01)。治疗后OX40、OX40LmRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01)。3.KD组急性期PBMC中OX40、OX40L与NFAT1、NFAT2蛋白表达呈正相关(P<0.01)。4.40 ug/ml anti-OX40单克隆抗体刺激正常儿童PBMC 48h,其NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表达显著高于非刺激组(p<0.01)。20ug/m1anti-OX40L单克隆抗体作用于KD PBMC 24h,其NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表达明显减少,与未抑制组有显著性差异(p<0.01)。结论:1.NFAT1、NFAT2、OX40、OX40L分子参与KD急性期的免疫应答过程。2.OX40-OX40L作为上游环节调控NFAT蛋白的表达。3.干预和阻断OX40/OX40L轴可能成为防治KD免疫损伤的一个新靶点。