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木材是自然界最重要的可再生资源,是人类制浆造纸、建筑业以及生物能源的主要原材料。改良木材性状,优化木材资源品质已成为当前林木育种的重要目标。在木材形成过程中,植物激素特别是生长素,被认为对维管形成层起始和次生木质部分化具有关键的调节作用。已有研究证实,生长素浓度在形成层中最高,随着韧皮部及木质部分化,其含量逐渐降低。根据目前的生长素信号转导模型,Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)和ARF(auxin response factor)是介导生长素响应的两个关键蛋白家族。研究表明,ARF与Aux/IAA对植物(原)形成层活动及维管系统的发育具有非常重要的作用,但其具体调控机制仍待进一步探索。杨树(Populus trichocarpa)是世界上分布最广的用材树种。随着其全基因组测序完成,杨树作为模式植物被广泛应用于树木次生发育的研究中。本研究以毛白杨为实验材料,通过对重要Aux/IAA及ARF基因的分析,揭示其对杨树次生发育的重要作用,初步弄清了生长素对木材发育的调控网络。主要研究结果如下:1.参与木材发育的杨树Aux/IAA候选基因筛选杨树基因组包含35个全长Aux/IAA编码基因,通过对已有的杨树微阵列表达数据(microarray)、转录组测序数据(RNA-seq)的分析,确定IAA9在木材发育相关组织中表达特异性较高,暗示其可能对木质部发育有调控作用。2.IAA9在维管形成层部位特异表达野生型毛白杨中,IAA9在木质部、韧皮部、茎、根中均有较高的表达量。启动子GUS染色结果表明,在维管形成层区域出现较强的GUS活性。原位杂交结果也进一步证实IAA9在维管形成层部位特异性高表达。3.IAA9是典型的Aux/IAA蛋白在野生型毛白杨中,外施生长素显著诱导IAA9表达。在烟草瞬时浸染实验中,外施生长素会减少IAA9叶片中的GFP信号,而在突变VGWPP氨基酸序列后的IAA9m中,生长素并不会对GFP信号产生显著影响。表明IAA9在转录水平上受到生长素的诱导,在蛋白水平上受到生长素的降解,且降解区域位于第二结构域。亚细胞定位实验显示,IAA9定位在细胞核中。酵母自激活实验证实IAA9是转录抑制子。因此IAA9具备了Aux/IAA蛋白的典型分子特征。4.IAA9过表达抑制杨树次生木质部形成构建IAA9过表达载体转入毛白杨,发现与野生型相比,转基因杨树的株高、茎直径等都明显下降。茎横切片甲苯胺蓝染色结果显示,过表达植株的次生木质部发育受到明显抑制,木质部细胞层数减少,相对面积下降。荧光定量PCR检测表明,转基因杨树中木质素合成关键酶基因表达量均有不同程度的下调。5.IAA9和ARF5能够发生蛋白相互作用酵母双杂交实验证实,IAA9和ARF5.1,ARF5.2能在体外发生相互作用。通过双分子荧光互补实验,确定IAA9和ARF5.1在体内也存在蛋白相互作用。6.ARF5.1能够恢复IAA9过表达植株次生发育表型将全长和去掉Ⅲ、Ⅳ结构域的ARF5.1过表达载体转入IAA9m-OE转基因植株中发现,全长ARF5.1对IAA9m-OE的回复在株高、木质部发育等方面,可接近野生型水平,ARF5.1Δ/IAA9m-OE中会完全恢复IAA9m-OE表型。酵母自激活和酵母双杂实验表明,ARF5.1Δ依然具有激活活性,但却不能和IAA9发生相互作用。7.IAA9-ARF5复合体调控HB基因表达荧光定量PCR结果显示,在IAA9m-OE转基因株系中,HB7和HB8基因表达量明显下调。用生长素分别处理野生型和IAA9m-OE转基因植株发现,这两个基因的转录水平都受到生长素的诱导,且在生长素信号被阻断的IAA9m-OE转基因植株中,生长素对其的诱导明显消失。这说明HB7和HB8基因可能参与生长素介导的木质部发育调控网络。ChIP实验结果证明,ARF5.1可直接结合HB7和HB8上游启动子序列,从而调控其基因表达。综上所述,IAA9在杨树木材发育相关组织中表达量高,并参与茎次生木质部的发育。IAA9通过和ARF5.1相互作用形成蛋白复合体,通过ARF5.1上的DNA结合区域结合下游基因HB7和HB8,并调控其表达,影响形成层向木质部细胞的分化,进而调控木材发育。这些结果将为解释生长素信号调控木材发育提供理论依据,为木材资源的优化奠定分子基础。