多巴胺(Dopamine，DA)可以激活胶质细胞，活化后的胶质细胞对多巴胺支配的神经元有保护作用。为了解DA作用于胶质细胞的分子机制，获得DA系统相关基因，我室利用消减抑制杂交和同源克隆技术，克隆并鉴定了星形胶质细胞在多巴胺作用下发生反应性变化时差异表达的基因，获得了两条DA调节表达的新基因，多巴胺相关转录因子(Dopamine-associate trscription factor，DAT1，GenBank#AF258348)是在此研究中获得的DA调节胶质细胞上调表达的基因之一。 生物信息学分析表明，该基因是仅有两个LIM结构域的LIM家族转录调节因子，该蛋白分子中除LIM结构域外无其他同源序列，属于LIM蛋白超家族中的LIM-only(LMO)亚家族。LIM结构域由两个串联的富含半胱氨酸的锌指基元组成，在进化中十分保守。目前已证实LIM蛋白可通过其LIM结构域介导蛋白与蛋白之间的相互作用，从而在机体的生长发育、分化及细胞骨架的组织中发挥非常重要的作用。 LIM蛋白可分为四类，其中LIM-HD蛋白可与DNA结合，具有转录因子的活性，可调节多种信号途径，它们在细胞命运决定和器官的发育过程中起重要作用。与LIM-HD蛋白相比，LMO蛋白在机体的发育中发挥了更重要的作用。此外，它还与肿瘤的发生有关。现已发现的脊椎动物的LMO亚家族的4个成员中，LMO1和LMO2基因表达于未成熟的T细胞中会阻止T细胞的进一步分化和成熟，它们的不正常表达可导致T细胞白血病，而且LMO2的表达与病情的恶化程度成正相关，进一步研究发现LMO2是血细胞发生的主要调节因子，它可能在多能干细胞阶段发挥作用；LMO4的表达受乳腺上皮细胞的发育调节，并在乳腺癌中上调表达，它可与CtIP(CtBP-interacting protein)和乳腺肿瘤抑制蛋白BRCA1(Breast cancer 1)相互作用形成复合体并抑制BRCA1的活性，从而导致乳腺癌的发生；最近的研究发现LMO4可与Deaf-1发生相互作用，并在影响神经管闭合的神经通路中有重要作用；还有研究者将LMO1、LMO3、LMO4基因分别敲除，发现不同基因缺失后小鼠的形态及功能变化不同，表明LMO亚家族中的成员分别在不同的发育途径中有重要作用。 DAT1从结构上看属于LMO家族，为初步了解DAT1的功能，本文应用原位杂交、RT-PCR、荧光定量RT-PCR、神经干细胞转染及酵母双杂交法等方法，从组织、细胞、第三军医大学博士学位论文分子水平对DATI的功能进行较全面的研究，通过本课题的研究不仅能初步明确DATI在中枢神经系统(eentral nervous system，CNs)发育、分化中的作用及其可能的机制，为进一步的功能研究提供理论依据，而且对了解神经系统肿瘤及退行性疾病的发生有重要的应用价值。 主要结果如下: (1)生物信息学的基因表达谱分析发现与DATI同源的EST有100多条，大多数EST分布于胎脑、成年脑、脑肿瘤、肺及肺部的良性肿瘤等组织。SAGE分析发现DATI在脑及神经系统肿瘤组织中表达非常广泛;RT一PCR方法检测发现DATI只在脑组织中特异表达，而其它组织如心脏、肺、肝脏、骨骼肌、’肾脏、翠丸、卵巢等未见表达;DATI在培养的正常星形胶质细胞C8中不表达，在胶质瘤、神经母细胞瘤等细胞株中有不同水平的表达，DATI的过表达可促进培养的C8胶质细胞增殖。DAT lmRNA阳性反应产物主要位于成年大鼠及小鼠CNS神经元的胞浆和突起内。DAT lmRNA阳性神经元可见于大脑、小脑、丘脑、脑干、脊髓，强阳性信号主要出现于嗅球、梨状皮质、内嗅皮质、海马CAI区、齿状回、红核、三叉神经运动核、舌下神经核、室旁核、黑质、面神经核、网状核等部位;中等强度的染色见于中央灰质、脊髓灰质、视前区及终纹床核等核团;较弱的阳性细胞见于丘脑、小脑的部分核团等部位。上述结果提示DATI可能参与神经系统的多种活动，如学习记忆、嗅觉、感觉、运动、多巴胺神经递质活动的调节，而且可能参与胶质瘤等神经系统肿瘤的发生。 (2) DATI的发育学表达研究发现，DATlmRNA在小鼠胚胎期E10.5天即有表达，且仅限于整个脑泡组织内，胚体其它区域均为阴性，Ell.5天脑区信号逐渐加强，无核团及脑区的特异性，胚体其它部分仍为阴性，E15.5一PO期的切片原位杂交结果显示，D户Jl阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色，P7天DATI阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中，但仍在大部分脑区看到弱的阳性染色，在少数核团可看到中等强度的着色，P14一P60 DATlmRNA表达范围较P7逐渐缩小，但仍有广泛表达，阳性信号主要集中于不同核团，表达有强弱之分;阳性着色主要定位于细胞质，但也可见到有些细胞核内的阳性染色。荧光定量RT一PCR结果表明，DATI在出生前高表达，P7后表达水平急剧下降，至成年都维持在一个较低的的水平。 以上结果表明DATlmRNA在胚胎期有广泛而高水平的表达，无核团及脑区的特异性，出生后表达下降，且逐渐局限于特定的脑区与核团，提示DATI基因可能与小鼠出生前脑的发育以及生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关。 (3)DATI瞬时转染神经千细胞(neural stem eells，NSCs)后的诱导分化试验表明，第三军医大学博士学位论文DATI转染可使NSCs细胞分化为Mash一1阳性的细胞增加，而Mash的表?