白细胞介素-10信号转导机制对C57BL/6和MRL/lpr<'->小鼠免疫效应细胞功能及活性影响的比较

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanfenng
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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病。许多研究已证实SLE患者血清白细胞介素-10(IL-10)水平明显升高并与疾病的活动有关。现已知IL-10必须与其特异性受体结合才能发挥作用,而在前期工作中我们发现NZW小鼠白细胞介素-10受体α链(IL-10RA)基因编码区序列有多处碱基改变,其中G1146A密码子改变导致编码氨基酸改变,从而造成承担IL-10信号转导负向调节的酪氨酸激酶JAK1和TYK2磷酸化结合模序缺失,该模序缺失后IL-10经NZW型IL-10受体的信号转导不仅不能抑制细胞免疫和炎症反应,反而能增强体液免疫反应,从而介导一系列病理免疫过程导致SLE发病。而对众多品系小鼠IL-10RA第1146号碱基进行聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)发现仅SLE模型小鼠MRL/Apr-的IL-10RA基因型与NZW小鼠相同,其碱基序列完全一致,并经测序分析得到确认,故推测IL-10R编码基因中某些位点多态性可导致相应氨基酸改变,从而引起受体功能改变并进一步影响信号转导系统,最终使机体对疾病的易感性发生改变。我们分别以C57BL/6和MRLApr-小鼠为研究对象,对其腹腔巨噬细胞和脾细胞的功能及活性进行检测,为进一步研究IL-10受体信号转导机制及其在SLE发病过程中所起的作用奠定了基础。 材料与方法: 一、材料 1、动物:SPF级C57BL/6和MRL/lpr-小鼠,雌性,8~10周龄。 2、主要试剂与来源:thioglycollate broth(BD公司);重组小鼠IL-10(rmIL-10)(R&D公司);BioEasySYBR Green I Real Time PCR Kit(博曰科技有限公司);兔抗小鼠IgG(H+L)ads、兔抗小鼠IgG(H+L)ads-HRP、山羊抗小鼠IgM抗体ads、山羊抗小鼠IgM抗体ads-HRP、羊抗兔IgG(H+L)mouse/human ads-HRP(Southern Biotechnology Associates,Inc);兔抗小鼠JAK1、TYK2、STAT3(Santa Cruz Biotechnology);兔抗小鼠p-STAT3、β-actin(Cell Signaling Technology,Inc);SuperECL plus超敏发光液(普利莱基因技术公司)。 二、方法: 1、细胞制备与培养实验前三天给小鼠腹腔注射4.05%thioglycollate broth 2ml/只,实验当天分别制备巨噬细胞和脾细胞,接种巨噬细胞于6孔培养板和96孔培养板中,4h后换液1次;接种脾细胞于96孔培养板中。向各孔添加终质量浓度分别为0.01、0.1、l和10ng/ml IL-10继续培养,对照组予等量无血清培养基。 2、MTT比色法检测细胞增殖96孔培养板于37℃5%CO2培养箱中培养72h后,按MTT比色法检测巨噬细胞和脾细胞体外增殖情况,检测波长570nm,参比波长630nm。 3、Real time PCR检测炎性细胞因子72h后取出6孔培养板,预冷PBS洗2遍,收集细胞提取总RNA,读取RNA样品在260nm和280nm波长处的OD值。以OligodT进行逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行real time PCR扩增,内参照采用β-actin。 4、ELISA检测细胞培养上清抗体6d后取出96孔培养板,收集细胞上清,采用双抗体夹心法检测IgG、IgM。 5、免疫印迹检测信号转导分子收集细胞,提取胞内蛋白,取已变性蛋白定量,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳、转膜、封闭、加一抗、二抗室温孵育,增强化学发光法(ECL)进行化学发光,台风扫描仪扫描成像,并对蛋白条带做灰度值测定。 三、统计学分析:实验数据采用均数±标准差表示,组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),用SPSS13.0软件完成。 结果: C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力及其产生的炎性细胞因子量、脾细胞增殖能力及其合成抗体的水平均随IL-10刺激浓度的增加而递减;MRL/lpr小鼠腹腔巨噬细胞增殖能力及其产生的炎性细胞因子量、脾细胞增殖能力及其合成抗体水平随IL-10刺激浓度的增加而递增;胞浆蛋白信号转导分子JAK1、TYK2、STAT3在两种小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞中均有表达,但MRL/lpr小鼠无论是脾细胞还是巨噬细胞其STAT3磷酸化水平均明显低于C57BL/6小鼠(p<0.01)。 讨论: 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病,SLE患者血清IL-10水平显著高于正常人并与狼疮活动密切相关,但IL-10在狼疮中的发病机制存在争议。动物实验也表明IL-10很可能在几种自身免疫病的发生发展过程中扮演重要角色。在SLE的发病过程中,IL-10异常是SLE的重要易感因素之一,而IL-10的活性是通过细胞表面受体(IL-10R)介导的,故推测后者在SLE发病中也具有相当重要的地位。而近年来研究发现IL-10受体(IL-10R)编码基因中许多位点存在多态性,某些位点的多态性可导致相应氨基酸改变,从而引起受体功能改变并进一步影响信号转导系统,最终使机体对疾病的易感性发生改变。 目前,对IL-10信号传导通路了解最详细的是JAK/STAT(Janus Kinase/Singnal Transducer and Activator of Transcription)系统。IL-10/IL-10R相互作用通过JAK1、TYK2蛋白激酶使特异的酪氨酸残基发生磷酸化,从而使得STAT3分子上的酪氨酸依次被连接于受体的JAKs磷酸化进而启动基因转录。 我们通过免疫印迹检测两种品系小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞的信号转导分子发现MRL/lpr小鼠的蛋白磷酸化水平明显弱于C57BL/6小鼠,由此我们推测由于磷酸化水平低下造成STAT3不能或者不能完全激活以致后续信号不能或者不能充分下传,致使IL-10抑制增殖的效应随之消失。 IL-10在正常C57BL/6小鼠体外研究中发挥抑制效应,而在SLE模型鼠MRL/lpr-小鼠体外研究中发挥增殖效应,由此我们推测正是因为IL-10R基因突变造成IL-10与IL-10R结合后其后续信号下传异常导致IL-10功能发挥异常,结果IL-10不但不能抑制MRL/lpr-小鼠的细胞免疫和炎症反应,反而促进其体液免疫反应的发生进而介导SLE一系列的病理免疫过程,结合各种内外因素从而导致SLE的发病。当然,这一推测还有待进一步证实。 结论: IL-10不但不能抑制MRL/lpr-小鼠的细胞免疫和炎症反应,反而促进其体液免疫反应的发生,从而介导一系列病理免疫过程,导致SLE发病。
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