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造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是治疗许多血液系统疾病的重要手段,目前常用的移植供源包括骨髓,外周血和脐血。但是,移植技术的开展受到供源不足和配型成功率低的限制。因此,开发新的移植供源具有重要意义。胚胎干细胞可能满足这项需求。临床上移植开展常将CD34抗原作造血干细胞的标记,体外研究表明通过诱导自发分化,或者与S17,OP9等基质细胞共培养的方法已经能够将胚胎干细胞分化为CD34+细胞。但是体内实验表明,这些分化的CD34+细胞并不能完全模拟脐血等移植供源的功能。脐血因其具有相对容易获得性,低的感染率和低的移植物抗宿主反应被应用到移植上。那么研究胚胎干细胞来源的CD34+细胞与脐血来源的CD34+细胞的差异对于了解胚胎干细胞分化机制非常重要。体内研究表明,在胚胎发育过程中,造血干细胞主要由中胚层发育而来,产生造血干细胞的主要场所是主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonad-mesonephros, AGM)和胎肝(fetal liver, FL)。在胎肝产生造血干细胞过程中,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)机制起到了重要的作用。在体外研究中,关于EMT机制在胚胎干细胞向CD34细胞分化中作用尚无定论。因此,探讨EMT机制在胚胎干细胞向CD34+分化过程的作用将会有一定的价值。已有研究表明,在胚胎干细胞分化的过程中干细胞标记会减少或消失,这些标记的减少或消失是否也与CD34有关联呢?在此假设的基础上,我们研究了胚胎干细胞向CD34+细胞分化过程中具有代表性的干细胞标记NANOG;和EMT相关的重要的钙粘蛋白E-cadherin和N-cadheriri; EMT相关转录因子Snail1, Snail2,Zeb1, Zeb2的表达变化,并比较了纯化后的胚胎干细胞来源和脐血来源的CD34+细胞以上分子的表达变化。研究发现1.胚胎干细胞分化为CD34+细胞过程中NANOG的表达水平逐渐降低；纯化后的胚胎干细胞来源的CD34+(human embryonic stem cell-derived CD34+,hESCs-CD34+)细胞的NANOG水平高于纯化后脐血来源CD34+(umbilical cord blood-derived CD34+, UCB-CD34+)细胞。即随着胚胎干细胞向CD34+细胞分化,hESCs-CD34+细胞NANOG表达逐渐下降,但仍然高于UCB-CD344细胞。2.胚胎干细胞分化为CD34+细胞过程中,EMT相关上皮性钙粘蛋白E-cadherin表达逐渐下降：间质性钙粘蛋白N-cadherin逐渐上升；EMT相关转录因Snail1, Snail2, Zebl, Zeb2表达水平逐渐上升。纯化后hESCs-CD34+细胞E-cadherin的表达高于纯化后UCB-CD34+细胞；N-cadherin的表达低于纯化后UCB-CD34+细胞；转录因子Snail1, Snail2, Zeb1,Zeb2的表达低于化后UCB-CD34+细胞。即随着胚胎干细胞向CD34+细胞分化,hESCs-CD34+细胞E-cadherin表达逐渐下降,但仍然高于UCB-CD34+细胞；N-cadherin和转录因子Snail1, Snail2, Zeb1, Zeb2表达逐渐上升,但仍低于UCB-CD34+细胞。第一部分人胚胎干细胞培养及诱导分化为CD34+细胞目的研究人胚胎干细胞的培养方法以及用不同方法将hESC-H9诱导分化为CD34+细胞方法以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)作为滋养层,将人胚胎干细胞细胞系hESC-H9进行二维培养,对培养细胞进行干性标记时相专一性抗原(stage specific embryonicant, SSEA) SSEA-4,肿瘤识别抗原(tumor rejection antigen, Tra) Tra-1-81以及碱性磷酸酶染色检测；利用胚胎干细胞诱导自发分化和与基质细胞OP9共培养诱导分化的方法得到CD34+细胞；对诱导过程中不同时间点CD34变化进行流式分析和Real-time PCR检测。结果hESC-H9表达干细胞标记SSEA-4及Tra-1-81,碱性磷酸酶染色阳性；以自发分化和OP9诱导分化的方法可以得到CD34+细胞,CD34+细胞比例在培养第8天至第10天为3%-5%,达到最大值；用流式细胞仪检测,OP9诱导分化方法得到的CD34+细胞分群更为明显,Real-time PCR检测证实CD34+细胞变化趋势。第二部分人胚胎干细胞来源CD34+细胞和脐血来源CD34+细胞NANOG表达比较目的研究hESC-H9诱导分化为CD34+细胞过程中不同时间点、hESCs-CD34+细胞与UCB-CD34+细胞干细胞标记NANOG的表达比较方法在hESC-H9诱导分化为CD34+细胞过程中,收集分化不同时间点的细胞,比较NANOG的变化；hESC-H9诱导分化为CD34+细胞D8收集hESCs-CD34+细胞,用流式细胞仪分选纯化后hESCs-CD34+细胞；从临床收集脐血标本,用磁珠分选的方法获得纯化后UCB-CD34+细胞,比较两者来源CD34+细胞中NANOG的表达差异。结果在hESC-H9诱导分化CD34+细胞过程中,NANOG的表达量逐渐下降；纯化后hESCs-CD34+细胞的NANOG的表达较UCB-CD34+细胞高。第三部分人胚胎干细胞来源CD34+细胞分选和脐血来源CD34+细胞EMT相关分子表达比较目的研究hESC-H9诱导分化为CD34+细胞过程中不同时间点、hESCs-CD34+细胞与UCB-CD344细胞EMT相关分子的表达比较方法在hESC-H9诱导分化为CD34+细胞过程中,收集分化不同时间点的细胞,比较EMT相关分子E-cadheri、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2的表达变化；hESC-H9诱导分化后D8收集hESCs-CD34+细胞,用流式细胞仪分选纯化后hESCs-CD34+细胞；从临床收集脐血标本,用磁珠分选的方法获得纯化后UCB-CD34+细胞,比较两者来源CD34+细胞EMT相关分子E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2Zeb1和Zeb2的表达差异。结果在hESC-H9诱导分化CD34+细胞过程中,随着分化时间的延长,上皮性标记E-cadherin的表达量逐渐下降；间质性标记N-cadherin逐渐上升；EMT相关转录因子Snai1、Snail2、Zeb1、Zeb2的表达量逐渐上升；纯化后hESCs-CD34+细胞的E-cadherin的表达水平较UCB-CD344细胞高,N-cadherin及转录因子Snail1、Snail2、 Zeb1、Zeb2的表达水平较UCB-CD34+细胞低。综上所述,首先,本研究鉴定了hESC-H9的干细胞特性。其次,通过诱导自发分化和与OP9共培养的方法能够诱导hESC-H9分化为CD34+细胞。结果证实,在诱导分化的过程中,CD34的表达逐渐增高；干细胞标记NANOG的表达逐渐下降；与EMT相关的上皮性标记表达逐渐下降,间质性标记表达逐渐上升,转录因子的表达也逐渐上升。最后,比较纯化后hESCs-CD34+细胞和UCB-CD34+细胞,我们发现纯化后hESCs-CD34+细胞的干细胞标记NANOG, EMT相关上皮性标记E-cadherin,比UCB-CD34+细胞高,但是间质性标记及转录因子比UCB-CD34+细胞低,提示胚胎干细胞诱导分化为CD34+细胞过程中可能发生了EMT转变,但EMT转变不完全。