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目的:人胰腺癌是临床常见高度恶性肿瘤之一,手术可切除率低,术后5年生存率不足5%;而在不可切除的病例中,化疗和放疗副反应大,且不能提高患者生存期。因此,提高治疗效果,探索胰腺癌的基因治疗有重要意义。自杀基因的靶向性及载体是限制基因治疗的瓶颈。本研究通过构建hTERT启动子调控的,腺相关病毒介导的PE38KDEL基因载体,体外观察对人胰腺癌细胞蛋白合成和诱导凋亡,体内观察对裸鼠移植瘤生长抑制情况。方法:1、hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因载体的构建;提取人基因组DNA, PCR扩增人hTERT启动子,插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方Mlu Ⅰ单克隆位点,构建成质粒pAAV-hTERT-hrGFP,通过测序选择人hTERT启动子片段正向插入的质粒pAAV-hTERT-hrGFP;通过基因合成PE38KDEL片段,然后插入pAAV-hTERT-hrGFP的hTERT启动子尾部Xba Ⅰ和Mun Ⅰ位点,构建成质粒pAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP;利用磷酸钙共沉淀法将载体质粒PAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞,“氯仿处理·-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”三步法浓缩和纯化rAAV, SDS-PAGE法检测病毒的纯度,电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。2体外实验:将实验分成3组:空白对照组、空病毒组和pAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP组。rAAV均是以1×106v.p/ce11转染MiaPaCa2人胰腺癌细胞,用及WI-38人胚肺成纤维细胞,观察绿色荧光表达情况,检测hTERT启动子的肿瘤特异性。利用亮氨酸掺入法、caspase活性测定法、Real-Time PCR法、ELISA法、TUNEL法、MTT法分别观察病毒对人胰腺癌细胞蛋白合成、细胞凋亡、细胞增殖的影响。Western Blot法检测caspase-3,-8,-9,Bcl-2,Mcl-1,Bcl-XL的变化,初步探索PE38KDEL基因诱导细胞凋亡的机制。3、体内实验:构建将对数生长期的MiaPaCa2人胰腺癌细胞以5.0×106个接种于12只裸鼠背部皮下建立裸鼠肿瘤移植模型。通过尾静脉注射或瘤内注射方法,观察病毒载体对移植瘤生长的影响,30天后处死荷瘤裸鼠,取下肿瘤标本,备常规HE染色观察各组肿瘤细胞病理学坏死的表现;通过TUNEL方法检测肿瘤细胞中的凋亡情况;通过western blot检测PE38KDEL的表达。结果:1、构建的质粒pAAV-hTERT-hrGFP、pAAV-hTERT-PE83KEL-hrGFP通过酶切及测序鉴定结果是正确;包装的rAAV经电镜检测形态正常,SDS-PAGE法检测病毒的纯度高,ELISA法检测滴度达1.2×1012v.p/ml。2、体外实验:本实验构建的病毒转染人胰腺癌细胞MiaPaCa2和人胚肺成纤维细胞WI-38后,荧光镜下观察绿色荧光蛋白表达情况发现,MiaPaCa2人胰腺癌细胞中荧光蛋白的表达率为44.2%,WI-38人胚肺成纤维细胞中荧光蛋白表达率<5%。病毒转染后24小时,细胞蛋白合成90%受到抑制,伴随细胞活性下降。MTT方法检测发现,病毒转染后24h、48h、72h,MiaPaCa2人胰腺癌细胞凋亡率分别为:25.2%,37.4%,58.3%。caspase活性测定及Western blot检测发现病毒转染后72小时,caspase-3,-8,-9分别被激活,伴随抗凋亡蛋白Mcl-1的显著降低。3、体内实验:从肿瘤的生长曲线图中,我们发现,空白对照组与空载病毒组之间未发现有显著性差异,实验组能显著抑制肿瘤的生长。显微镜下观察实验组细胞出现明显的凋亡,且凋亡区域的面积要大于对照组。此外,western blot检测到了PE38KDEL的表达。结论1.成功构建了hTERT启动子调控腺相关病毒介导的PE38KDEL基因表达载体,为体内外试验奠定了基础。2.体外实验表明,hTERT启动子能特异性调控PE38KDEL及GFP在端粒酶阳性的MiaPaCa2人胰腺癌细胞中特异性表达;rAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP能抑制MiaPaCa2人胰腺癌细胞蛋白合成及诱导其凋亡,其诱导凋亡的机制为激活caspase-3,-8,-9和抑制抗凋亡蛋白Mcl-1。3.体内实验表明,rAAV-hTERT-PE38KDEL-hrGFP能显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长,其机制为抑制蛋白合成和诱导细胞凋亡,在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中检测到了PE38KDEL蛋白的表达。