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目的抑郁症是一种发病机制复杂的常见精神疾病,具有高患病、高复发、高致残、高医疗成本的特点。抑郁症与应激密切相关,研究表明,长期的慢性心理应激会造成神经系统的退行性病变,不仅会引起显著的躯体症状,而且还会引起认知损伤,引发抑郁症。心理应激引发抑郁状态的核心在于使大脑海马神经元细胞发生凋亡,中间关键机制可能涉及使活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生过多诱发氧化应激,从而通过对蛋白质、DNA和生物膜等直接损伤和激活与其密切相关的线粒体细胞凋亡途径促使海马神经元细胞凋亡发生。由于海马是抑郁症发病机制中的关键脑区,因此,如何抑制海马神经元的凋亡成为治疗抑郁症的关键。本团队在前期研究发现,针刺可以从信号通路及相关因子等途径改善海马神经元凋亡情况,但关于心理应激一氧化应激一线粒体细胞凋亡途径与抑郁症之间联系的相关研究甚少,针刺改善心理应激引发凋亡的机制是否涉及通过调控氧化应激抑制凋亡途径的相关报道也极为少见。因此,本研究延续前期的针刺抗凋亡的研究,选择孤养结合慢性束缚心理应激抑郁模型大鼠为实验对象,模拟人类抑郁发病的心理应激过程;选取心理应激密切相关的氧化应激和氧化应激主要激活的线粒体细胞凋亡途径作为研究重点。采用针刺“百会”“印堂”“三阴交”穴作为干预措施,氟西汀作为阳性对照药,通过旷场实验、体质量和糖水偏好实验评价心理应激模型的成立,运用荧光探针技术观察大鼠海马组织活性氧含量(ROS)和运用蛋白质印迹法(Western Blot)观察线粒体细胞凋亡途径上的主要效应因子细胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteine-containing Aspartate-specific Proteases-3, caspase-3)、凋亡诱导因子(Apotposis Inducing Factor, AIF)的蛋白表达水平,研究针刺对心理应激引起的活性氧(ROS)含量的调节作用和针刺的抗凋亡机制是否涉及抑制活性氧(ROS)引起的线粒体细胞凋亡途径,旨在结合前期的研究,初步构建针刺的抗凋亡网络,完善针刺的抗抑郁机制,为临床针刺防治心理应激引起的早期抑郁提供实验依据。.方法1.动物分组:将32只雄性SD大鼠随机分成空白组、模型组、针刺组、氟西汀组,共4组,每组8只。各组大鼠在实验前适应性喂养一周。2.造模方法:本课题应用慢性束缚方法建立慢性心理应激动物模型,具体方法:应用铁丝网,两端用夹子固定,保持大鼠呼吸通畅,且不压迫大鼠,躯体应激小,大鼠承受到的仅是心理应激,基本控制了生理应激对其的影响,结果主要反映心理和情绪因素的作用,于每日9:00-15:00束缚应激六小时,束缚期间,禁食禁水。束缚结束后,将大鼠放回笼中,自由摄食摄水。连续束缚28天。3.处理方法(1)空白组:常规饲养,每日仅在9:00-15:00断食断水,其余时间自由摄食摄水,持续28天。(2)模型组:慢性束缚结合孤养,每日9:00-15:00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水,持续28天。(3)针刺组:慢性束缚结合孤养,每日9:00-15:00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水,同时在每日束缚应激处理前1h选取相当于人体解剖部位的“百会”、“印堂”、“三阴交”穴,进行针刺干预,留针20min,每日1次,持续28天。(4)氟西汀组:慢性束缚结合孤养,每日9:00-15:00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水;同时在每日应激刺激前30min,用盐酸氟西汀分散片用蒸馏水配成1.8mg/kg的混悬液,以l0ml/kg灌胃给药。4.检测指标及方法采用旷场实验(Open-field Test)、体质量(Body Weight)和糖水偏好实验(Sucrose Preference Test)评价模型大鼠行为学改变情况,运用DCFH-DA荧光探针技术检测大鼠海马组织活性氧(ROS)的含量,使用蛋白质印迹法(Western Blot)检测海马组织细胞色素C, caspase-3和AIF的蛋白表达水平。结果1.行为学变化实验前各组大鼠行为学表现均无统计学差异(均P>0.05)。实验结束后,模型组大鼠旷场实验水平穿越格数、垂直竖立次数、体质量和糖水消耗量及糖水偏好指数均低于空白组(均P<0.01);与模型组相比,在旷场实验方面,针刺组与氟西汀组大鼠水平穿越格数、垂直竖立次数均显著高于模型组(均P<0.01),并且针刺的改善作用显著优于氟西汀的作用(P<0.01,P<0.05);在体质量方面,针刺组和氟西汀组大鼠的体质量增加,有统计学差异(P<0.01,P<0.05);在糖水偏好实验方面,针刺组和氟西汀组大鼠的糖水消耗量和糖水偏好指数显著增加(均P<0.01)。2.海马组织活性氧(ROS)含量实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织活性氧(ROS)含量水平显著升高(均P<0.01);与模型组相比,针刺组和氟西汀组大鼠海马组织活性氧(ROS)含量水平显著降低(均P<0.01)。3.海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,针刺组和氟西汀组大鼠海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)。但在下调caspase-3蛋白表达水平方面,针刺改善作用显著优于氟西汀(P<0.01)。4.海马组织AIF蛋白表达水平实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织AIF蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,针刺组和氟西汀大鼠的海马组织AIF蛋白表达水平均显著降低(均P<0.01)。结论1.孤养结合慢性束缚心理应激刺激可使大鼠出现抑郁样行为,针刺与氟西汀干预均能改善抑郁模型大鼠行为学变化,在改善探究行为和躯体活动状态方面针刺明显优于氟西汀。2.针刺干预均能有效降低心理应激导致的模型大鼠海马组织活性氧(ROS)高含量水平,抑制氧化应激引起的一系列不良效应。3.针刺干预能显著降低模型大鼠海马组织线粒体细胞凋亡途径的关键因子细胞色素C和caspase-3、AIF的蛋白表达水平,有效抑制模型大鼠海马线粒体细胞凋亡途径的激活,可能与下调活性氧(ROS)含量有关。4.针刺可能通过调控慢性心理应激—氧化应激—线粒体细胞凋亡途径这一特殊的通路对海马神经元的凋亡产生改善效应,从而发挥抗抑郁的作用。