猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌,能引起人和猪的脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎、败血症以及突发性死亡。中国于1998年和2005年在江苏和四川局部地区暴发了较大规模的猪及其人感染猪链球菌病例,累计报告人感染猪链球菌病例达204例,其中死亡38例,不仅对养猪业造成巨大威胁,而且严重影响公共卫生安全。值得注意的是两度人重症感染死亡病例多表现为中毒样休克综合征。迄今为止,对猪链球菌毒力因子的认识非常有限,基本得到确认的毒力因子有荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)等,但由于毒力因子的多样性和复杂性,单靠现有毒力因子还不足以解释导致我国两度暴发猪链球菌病的原因。因此,分离和鉴定更多的SS2毒力因子已成为该领域的研究热点。　　微生物蛋白质组学是发掘新型毒力因子的有效手段。本课题组前期利用免疫蛋白质组学对我国流行株的细胞壁蛋白进行了研究,结果发现我国流行株细胞壁上存在着8个不同的抗原,具有很好的免疫保护原性,是潜在的毒力因子。　　目前已完成测序的猪链球菌菌株有欧洲株p1/7和美洲株89/1591。2005年中科院基因组研究所完成了98和05年暴发流行株98HAH12和05ZYH33的测序工作,并完成了无毒株05HAS68的草图用作比较研究,结果显示在中国流行株中存在一个大小为89kb的可能毒力岛PAI,命名为89K。序列比对和实验证明89K仅在中国流行株中存在。因此,89K毒力岛很可能是导致我国猪链球菌病暴发流行的因素之一。对89K进一步功能注释结果显示89K上可能与毒力相关的基因有:3个控制物质运输的ABC transporter,2个双组分系统(TCSTS),3个Ⅳ型分泌系统(T4SS)的组件。　　本研究主要从两个方面对中国猪链球菌2型毒力因子进行探讨,一是表面蛋白上5个基因的分析和鉴定,二是89K毒力岛上ABC transporter上3个基因的分析和鉴定。表面蛋白上的5个基因是05SSU_0272、05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664,89K毒力岛上的3个基因是05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948。论文分三个部分对这些潜在毒力因子进行阐述。　　首先是免疫原性蛋白05SSU_0272及毒力的分析。05SSU_0272是新发现的猪链球菌表面蛋白,具有较强的免疫原性,在大鼠抗血清调理人全血杀菌试验中的杀菌率在50％以上。对05SSU_0272序列分析发现其含有LPXTG基序,含有该基序的表面蛋白在许多致病菌中都有发现。分析蛋白序列发现该蛋白含有2个高度一致的重复序列,且该重复序列在不同菌株中存在多态性。05SSU_0272在GeneBank上功能注释为延伸因子,但是突变株Δ0272表达谱结果发现,受其影响的基因只有为数不多的几个,说明它可能不是延伸因子,而是另具其它功能的蛋白。通过同源重组方法获得05SSU_0272突变株Δ0272,同时构建其互补株CΔ0272。细胞黏附实验发现,Δ0272对Hep2细胞的黏附能力明显降低而CΔ0272又重新恢复了Δ0272的黏附能力,扫描电镜同时印证了这个结果;全血杀伤结果表明,Δ0272在人全血中抵御血液中天然免疫细胞的吞噬和杀菌能力减弱,更容易被宿主清除,而CΔ0272重新恢复了其在血中的存活能力;CD1小鼠竞争感染实验说明突变株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠脑膜炎感染实验中突变株与野生株在72h血中菌数一致而在72h脑中野生株菌数为突变株的几十倍,说明野生株比突变株通过血脑屏障能力强;猪竞争感染实验中CI值小于0.001,说明突变株较野生株而言更容易被清除。结果表明该蛋白很可能是猪链球菌潜在的毒力因子,但其在猪链球菌致病过程中的具体作用还需进一步研究。　　05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664是通过蛋白质组学同时发现的新型免疫原性蛋白,WB结果显示05SSU_1664可能为我国高致病株与普通致病株及国外菌株的差异表达蛋白;05SSU_1538、05SSU_1083重组抗原在6名病人和5名健康人血清中的抗体水平表现出显著性差异;05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664重组抗原的抗体在人工感染小型猪前后血清中的变化情况统计学上差异显著;05SSU_1083在大鼠抗血清调理人全血杀菌试验中的杀菌率达到50％以上。序列分析发现,05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1664含有LPXTG基序和信号肽序列,05SSU_1083含有信号肽序列,含有这些序列的表面蛋白很可能与毒力相关。本研究对这4个基因尝试了敲除工作,获得了这几个新型免疫原性蛋白的突变株。细胞黏附实验发现,Δ1664对Hep2细胞的黏附率10.82％低于野生株05ZYH33的黏附率14.16％且有统计学差异,Δ1083对Hep2细胞的黏附率13.25％低于野生株05ZYH33的黏附率15.47％;全血杀伤结果表明,野生株05ZYH33在人全血中杀伤率为33.96％,Δ1000为72.95％,Δ1538、Δ1664、Δ1083分别为28.06％、37.60％、27.74％,结果说明Δ1000在人的全血中抵御血液中天然免疫细胞的吞噬和杀菌能力减弱;CD1小鼠竞争感染实验中Δ1000、Δ1538、Δ1664、Δ1083与野生株的竞争感染指数分别为:0.60±0.24、0.61±0.16、0.82±0.29、0.77±0.30,说明这些突变株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠脑膜炎感染实验中Δ1000、Δ1538和Δ1664与野生株05ZYH33在血中菌数一致而在脑中野生株菌数为突变株的几十倍,说明野生株比突变株通过血脑屏障能力强,Δ1083与野生株05ZYH33在血中和脑中菌数一致;猪竞争感染实验,05ZYH33/Δ1664组在12h、24h、36h和48h的CI值分别为1.45、0.30、0.27、0.07,05ZYH33/Δ1083组在12h、24h、36h和48h的CI值分别为0.45、0.32、0.25、0.07,05ZYH33/Δ1000在12h、24h、36h、48h和60h的CI值分别为0.11、0.07、0.37、0.13、0.008,CI值小于0.1,说明这些突变株的增殖受到了野生株的抑制。结果表明这些免疫原性蛋白可能影响到我国猪链球菌2型的毒力,是潜在的毒力因子。　　ABC转运蛋白可能参与毒素的输出,与细菌的致病性和多药耐药相关。认为89K毒力岛可能是导致中国猪链球菌病暴发流行的因素之一。实验室前期构建了05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948这3个基因的插入失活体,在动物实验中发现与野生株相比毒力降低,因此,构建了敲除突变体来消除失活突变体带来的极性影响。从溶血活性来看,野生株和突变株并无差异,但生长情况发现,Δ0948的生长速度要明显慢于野生株和其它突变株。Δ0948的Hep2细胞黏附实验、CD1小鼠实验、猪竞争感染实验结果说明其可能与毒力相关。Δ0946猪竞争感染实验说明其可能与毒力相关。Δ0910体内外实验说明其可能与毒力无关。89K毒力岛是否真是导致我国猪链球菌病暴发的因素之一还有待进一步探索。　　本文利用基因敲除技术共获得了中国猪链球菌2型野生株05ZYH33的8个突变株,其中3个位于89K毒力岛上,5个位于表面蛋白上。通过对这些新型毒力因子的筛选和鉴定,为进一步研究中国猪链球菌2型的发病机制奠定了基础。