论文部分内容阅读
研究目的:本课题旨在研究长链非编码RNA（long noncoding RNA,Lnc RNA）浆细胞瘤变异易位1（Plasmacytoma variant translocation 1,PVT1）在肺腺癌中的表达水平及生物学功能,探索Lnc RNA-PVT1在肺腺癌发生、发展中的作用机制,为肺腺癌的治疗提供新的靶点。研究方法:1、收集5例肺腺癌患者癌组织及癌旁组织,运用基因芯片技术检测肺腺癌患者癌组织及癌旁组织Lnc RNAs表达谱。2、利用实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）方法检测70例肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中Lnc RNA-PVT1表达水平,进一步验证芯片分析结果。3、取A549细胞及NCI-H1299细胞,分别构建Lnc RNA-PVT1过表达及干扰模型,并通过CCK-8细胞增殖实验、Ed U细胞增殖实验、Transwell小室实验、荧光激活细胞分选术（Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS）、荷瘤小鼠实验研究Lnc RNA-PVT1对肺腺癌细胞增殖、迁移能力以及体内成瘤能力的影响。4、运用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测Lnc RNA-PVT1在肺腺癌细胞中的分布。通过医学数据库（star Base）筛选Lnc RNA-PVT1的下游靶基因,并通过双荧光素酶报告实验验证Lnc RNA-PVT1与所预测的miRNA的相互作用。运用q RT-PCR检测miRNA在肺腺癌组织中的表达,通过Western Blot方法检测Lnc RNA-PVT1对miRNA的下游通路蛋白的表达水平。运用CCK-8细胞增殖实验、Ed U细胞增殖实验、Transwell小室实验检测miRNA在肺腺癌细胞增殖、迁移中的作用。5、通过医学数据库分析Lnc RNA-PVT1的上游转录调控因子,并通过双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验,验证预测的转录调控因子与Lnc RNA-PVT1的作用。运用q RT-PCR方法检测肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中上游转录调控因子的表达水平,并观察肺腺癌细胞中过表达该转录调控因子对Lnc RNA-PVT1表达的影响。研究结果:1、组织芯片结果显示,有超过900个Lnc RNA在肺腺癌患者癌组织和癌旁组织中存在差异性表达。其中,Lnc RNA-PVT1在肺腺癌组织中的表达水平是癌旁组织的3.84倍,是肺腺癌组织中表达上调最显著的几个Lnc RNA之一。结合文献阅读,发现Lnc RNA-PVT1是一个重要的促癌因子。因此,我们将其作为此次研究的重点。2、q RT-PCR结果显示,相较于癌旁组织,肺腺癌组织中Lnc RNA-PVT1的表达水平明显升高。此外,我们检测了三种肺腺癌细胞A549、NCI-H1299、NCI-H1650及一种正常人肺上皮细胞BEAS-2B中Lnc RNA-PVT1的表达,发现相较于BEAS-2B细胞,三种肺腺癌细胞中Lnc RNA-PVT1的表达水平均明显升高。3、细胞功能实验表明,过表达Lnc RNA-PVT1可促进肺腺癌细胞的增殖和迁移,干扰其表达会抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移,FACS实验结果显示,Lnc RNA-PVT1的过表达可促使肺腺癌细胞由G0/G1期转至S期,促进细胞周期进程,而干扰Lnc RNA-PVT1的表达可导致肺腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期。在荷瘤小鼠实验中,过表达Lnc RNA-PVT1可促进肺腺癌细胞在体内的生长,成瘤能力增强。4、FISH实验结果显示,Lnc RNA-PVT1广泛分布于A549细胞和HCI-H1299细胞的细胞质和细胞核中。通过Star Base数据库分析发现miR-140-5p可能是Lnc RNA-PVT1的下游靶基因,双荧光素酶报告实验证实了Lnc RNA-PVT1可与miR-140-5p结合。miR-140-5p在肺腺癌组织中表达下调,并且Lnc RNA-PVT1的过表达可降低肺腺癌细胞内miR-140-5p的表达。Western Blot实验结果显示,miR-140-5p可降低肺腺癌细胞中wnt1和β-catenin蛋白的表达,而过表达Lnc RNA-PVT1可逆转miR-140-5p对wnt1和β-catenin蛋白表达的抑制作用。在干扰Lnc RNA-PVT1表达的肺腺癌细胞中,加入miR-140-5p抑制剂,可部分恢复肺腺癌细胞的增殖和迁移能力。5、通过医学数据库分析发现转录因子3（transcription factor 3,TCF3）与Lnc RNA-PVT1启动子区有5个结合位点,双荧光素酶报告实验及Ch IP实验都证实了TCF3能与这5个预测位点结合。q RT-PCR检测结果显示肺腺癌组织中TCF3的表达水平明显升高,且TCF3的过表达使肺腺癌细胞中Lnc RNA-PVT1的表达上调,表明Lnc RNA-PVT1在肺腺癌重表达升高与TCF3密切相关。研究结论:1、本研究通过基因芯片技术筛选并进一步验证了Lnc RNA-PVT1在肺腺癌组织及细胞中的表达水平明显升高。2、Lnc RNA-PVT1的过表达促进肺腺癌细胞的增殖和迁移,而干扰其表达可抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移,且Lnc RNA-PVT1过表达增强肺腺癌细胞体内成瘤能力。3、Lnc RNA-PVT1可靶向结合miR-140-5p,Lnc RNA-PVT1的过表达可降低肺腺癌细胞内miR-140-5p的水平,并影响下游蛋白wnt1和β-catenin的表达,促进肺腺癌细胞的增殖和迁移。4、TCF3是Lnc RNA-PVT1的上游调控因子,Lnc RNA-PVT1在肺腺癌中的高表达与TCF3密切相关。TCF3/PVT1/miR-140-5p轴可能成为肺腺癌治疗的新靶点。