南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）无论在水相还是在非水相体系中都表现出优良的催化活性,被广泛用于食品、化工、医药和生物能源等领域。另一方面,应用领域的拓展需要脂肪酶具有更为优良的酶学特性和更高的表达水平。为了进一步提高脂肪酶CALB的耐温性和表达水平,更好地满足工业化应用的需要,本研究通过理性设计,成功地提高了其活性和耐高温的特性,并实现了其在巴斯德毕赤母菌（Pichia pastoris）中的高效表达。主要的研究工作如下:本研究首先比较分析了脂肪酶CALB自身的信号肽与α因子信号肽对毕赤酵母表达分泌脂肪酶效率的影响。发现与CALB自身信号肽相比,α因子信号肽能够显著提高CALB的分泌表达量,发酵上清液中CALB的水解活性提高了27%。为进一步获得高活性、耐温性好的脂肪酶,本研究基于CALB的三维结构信息,对氨基酸序列中的相关位点进行精确设计。脂肪酶CALB主要的突变位点为:第105位的Thr突变为Ala,第110位的Asn突变为Tyr,第154位的Met突变为Val,第173位的Ala突变为Gly,第188位的Leu突变为Phe,第260位的Val突变为Ala。所获得的突变体命名为CALB2a。与野生型CALB相比,脂肪酶CALB2a水解活力提高了794.4%。同时脂肪酶CALB2a的最适反应温度提高到了65℃,且在50℃下放置3 h后仍保留了75%以上的酶活。本研究随后将脂肪酶基因calb2a克隆进表达载体p AO815,并构建出含1-4个calb2a表达框的重组质粒。将上述质粒转化至P.pastoris后,获得了基因组中含1-4拷贝calb2a基因的重组菌株。产酶能力分析表明,与含1拷贝calb2a基因的菌株相比,4拷贝菌株酶活性提高了139.3%。在50-L发酵罐高密度发酵条件下,当甲醇诱导发酵168 h后,发酵上清液脂肪酶酶活达到3200 U/m L。通过理性设计,本研究成功地获得一种新型的高活性、耐高温的脂肪酶CALB突变株,并实现了其高效表达,为该酶的产业化和工业应用奠定了基础。