基因打靶是根据同源重组原理利用外源DNA替换细胞相应的染色体片段,对基因组进行精确操控的技术。由于细胞内自发的同源重组概率仅有1/106,甚至更低,极大地限制了基因打靶技术在转基因动物生产中的应用。研究表明在基因组中引入双链断裂切口(double-strand break, DSB)可以大大提高同源重组的效率,目前已经有多种嵌合酶可以识别并切割基因组特定位点从而产生DSB,而近几年发展起来的锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)是其中应用最广泛最有效的一种嵌合酶。该酶通过在特定基因组靶位点引入DSB,可以将基因打靶的效率提高几个数量级。MSTN是骨骼肌生长的负调控因子,其活性的丧失会引起动物肌肉的过度发育、肌纤维直径变大和／或数量的增加。目前,MSTN已经成为提高家畜产肉性能及治疗人类肌肉萎缩性疾病的重要研究对象。本研究拟采用ZFN技术在绵羊MSTN基因中靶向引入DSB,诱发细胞自身固有的非同源末端(non-homologous end-joining, NHEJ)修复途径提高MSTN基因敲除效率为通过胚胎工程手段获得产肉性能高的转基因家畜奠定基础。1.利用在线锌指设计软件ZiFit3.2查找MSTN基因中潜在的ZFN靶向结合位点,选择位于第三外显子中的一个ZFN靶位点,借助基于细菌双杂交的OPEN法(Oligomerized pool engineering)经两轮筛选分别获得了高亲和性结合MSTN靶位点的左侧ZFP库和右侧ZFP库。2.构建了含绵羊MSTN靶位点的酵母报告载体pAC-Ga14-VP16-ZFBS及ZFN酵母表达载体pLeu-LZFN和pTrp-RZFN。将报告载体和ZFN表达载体共转化至酵母中,用营养缺陷型培养基进行筛选,通过PCR检测酵母单克隆,结果显示有80%的单克隆发生了修复；但在阴性对照中亦检测到酵母自发的同源重组修复,因此,所获得ZFN的活性仍需进一步验证。3.根据CoDA法合成了两对可以与MSTN外显子1靶向结合的ZFPs,并构建了相应的ZFN腺病毒表达载体。包装病毒后感染绵羊胎儿成纤维细胞,western blotting检测表明重组腺病毒中ZFN能够在绵羊胎儿成纤维细胞中表达。构建了含靶位点的红色荧光报告载体pRS,与表达ZFN的腺病毒共同转染至绵羊胎儿成纤维细胞,48h后于倒置荧光显微镜下能够观察到部分细胞中有红色荧光,这表明突变的DsRed基因得到了修复。利用流式细胞仪分选发红色荧光的细胞,提取基因组,经PCR、酶切和测序鉴定,在细胞基因组中并未检测到靶基因发生突变。4.将CoDA法合成的两对ZFPs分别与野生型FokI及其突变型Sharkey连接,构建了两对野生型ZFNs(p1LZFN、p1RZFN和p2LZFN、p2RZF)和两对突变型ZFNs(p1LZFS、p1RZFS和p2LZFS、p2RZFS),并构建了双荧光报告载体pRGS。将4对ZFN与双荧光报告载体分别转染293T细胞,用流式细胞仪检测发绿光和红光的细胞数,结果表明第一对ZFNs活性显著高于第二对,突变型ZFSs的活性高于野生型ZFNs;将293T细胞中验证活性最高的第一对ZFSs和报告载体pRGS共转染绵羊胎儿成纤维细胞,经流式细胞仪分选得到占总细胞数1.7%的GFP修复细胞,有限稀释培养获得80个单克隆,利用PCR、测序鉴定最终得到两个MSTN基因突变细胞系；统计分析表明ZFNs在分选细胞中的突变率为2.5%,在总细胞中的突变率为0.0425%。5.构建了含一个靶位点的ZFNs有限表达报告载体pRGZS和含两个靶位点的有限表达报告载体pRGSZS,通过转染293T细胞表明pRGSZS中表达的ZFN能有效切割位于该报告载体两侧的靶位点,将编码ZFN的表达框从pRGSZS载体中剔除,因此降低了ZFN过量表达引起的细胞毒性；与转染pRGS和ZFN1相比其作用活性降低了4.5%,但是对细胞的毒性却降低了约40%。