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本研究从四川某猪场流产死胎及木乃伊胎中分离了一株猪细小病毒,命名为PPV-SC1株。该株病毒能在猪肾原代细胞、PK-15细胞、ST细胞和IBRS-2细胞上增殖并引起细胞病变,细胞出现聚集、融合现象:分离毒能凝集2%的豚鼠红细胞,血凝效价可达2110,血凝抑制效价可达2-9;荧光抗体染色在细胞核和细胞质中均可见特异性荧光,呈苹果绿色;电镜正染观察病毒为无囊膜、球形、大小约23nm的病毒粒子。 根据Ana I.Ranz等报道的PPV NADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0 kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建了重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC1 VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异:密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC1 VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC1 NS1基因在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV—SC1 VP2蛋白在77-82、291-304、362-373、400-411、465-477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60-68、81-88、266-275、351-357、398-404等位点处。 以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuI位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据PPV-SC1株VP2基因的序列及其pPI-2.EGFP多克隆位点的酶切位点,重新设计一对引物,以质粒pPVP2 DNA为模板扩增得到用于表达的PPV VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,pPI-2.EGFP.VP2 DNA真核转染后24h的荧光观察和转染液的ELISA检测结果表明同时表达PPV VP2基因和EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2构建成功,为进一步构建PRY重组PPV VP2基因活载体病毒奠定了基础。 采用磷酸钙转染系统,将PRV基因缺失疫苗SA215株DNA与PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2 DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blots核酸