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山羊奶富含短中链脂肪酸和不饱和脂肪酸,具有独特的营养价值和风味,泌乳过程中乳腺组织脂肪酸代谢是影响乳中脂肪酸组成的重要生理过程。过氧化物酶增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorsγ,PPARγ)是核受体PPARs家族中重要的一员,作为配体激活型转录因子,通过结合在靶基因PPRE元件上对脂肪酸代谢、脂滴形成与分泌等生理过程发挥调控作用。因此,分析PPARγ基因启动子结构及功能,为奶山羊乳脂代谢调控和羊奶风味形成机理研究提供重要理论与实验依据。本研究克隆得到西农萨能奶山羊PPARγ基因启动子区域,利用生物信息学分析启动子序列并通过缺失突变确定启动子核心区域;运用定点突变、过表达及干扰技术研究了转录因子C/EBPα对PPARγ基因的转录调控机制,同时对ROSI激活PPARγ基因转录的机制进行了初步研究。获得的主要结果如下:1.根据GenBank中牛的基因组序列,设计合成山羊PPARγ基因启动子克隆引物,利用PCR技术扩增得到奶山羊PPARγ基因5’侧翼序列2328 bp,包括转录起始位点上游2181 bp。利用在线软件对启动子片段进行生物信息学分析,结果显示,启动子上存在C/EBPα、PPARγ、SREBP、Sp1等多个转录因子结合位点,但不存在典型的真核生物元件TATA-box。通过缺失片段活性分析发现,PPARγ启动子活性中心位于转录起始位点上游194~108 bp。2.成功构建了C/EBPα基因过表达载体;过表达C/EBPα能够显著上调PPARγ基因mRNA水平和启动子活性,干扰C/EBPα抑制PPARγ表达同时下调启动子活性;定点突变分析发现分别突变4个C/EBPα结合位点(-1112 bp、-734 bp、-248 bp和-119 bp)均能显著下调启动子转录活性;突变位于转录起始位点上游119 bp处结合位点后,过表达或干扰C/EBPα基因对启动子活性没有影响。因此,C/EBPα基因能够通过位于启动子转录核心区域的C/EBP结合元件调控PPARγ基因的转录。3.定点突变奶山羊PPARγ基因启动子上三个PPRE元件,只有转录起始位点上游1285 bp和774 bp处PPRE元件的突变会导致启动子活性显著下调;对于野生型启动子,添加PPARγ基因过表达病毒和特异性激动剂ROSI均能增强启动子活性,进一步对突变型启动子进行过表达和激动剂处理,发现突变-774 bp处的PPRE元件,启动子活性不受PPARγ基因过表达影响,说明位于启动子上-774bp处的PPRE元件是介导ROSI调控PPARγ基因表达的关键元件。综上所述,本研究克隆得到西农萨能奶山羊PPARγ基因5’侧翼序列,通过缺失突变分析确定启动子转录核心区域位于-194~-108 bp。启动子上存在多个转录因子结合位点,其中位于核心区域的C/EBP结合元件是C/EBPα基因对PPARγ启动子发挥转录调控作用的关键元件。ROSI对PPARγ基因转录的激活作用通过其启动子上的功能性PPRE元件实现。