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[目的]通过体外培养正常皮肤角质细胞和瘢痕疙瘩角质细胞,应用慢病毒干扰Smad7基因和过表达Smad7基因,调控TGF-β介导的上皮-间质转化,阐述瘢痕疙瘩角质细胞获得抗凋亡特性、过度增殖及迁移性的作用及机制。[方法]1、选择科室前期通过健康人的重睑成形术切下的上睑皮肤培养正常皮肤角质细胞(NK细胞)、耳部瘢痕疙瘩及腹部瘢痕疙瘩标本培养瘢痕疙瘩角质细胞(KK细胞)为实验细胞。2、根据人Smad7目的基因的mRNA序列,全基因合成Smad7目的基因,构建Smad7过表达慢病毒载体及Smad7干扰慢病毒载体,通过筛选选择4段可能的干扰序列构建Smad7shRNA慢病毒载体及Smad7shRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞,转染293T细胞进行慢病毒包装。应用QPCR检测Smad7过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定Smad7过表达的有效性,并且筛选最佳干扰慢病毒。3、筛选最佳干扰和过表达慢病毒以及对照载体分别感染NK和KK细胞,并且使用1.5 ug/ml浓度的嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,干预后共分8组细胞,分组如下:NK-Control(正常培养的NK细胞);NK-NC:(对照慢病毒筛选的NK细胞);NK-shSmad7(干扰慢病毒筛选的NK细胞);NK-mSmad7(表达慢病毒筛选的NK细胞);KK-Control(正常培养的KK细胞);KK-NC(对照慢病毒筛选的KK细胞);KK-shSmad7(干扰慢病毒筛选的KK细胞);KK-mSmad7:(表达慢病毒筛选的KK细胞);通过Western-blot和QPCR检测Smad7和Smad3的相关性。4、采用CCK-8法观察8组细胞的增殖变化差异情况,流式细胞仪检测8组细胞的凋亡变化差异情况,Transwell小室检测8组细胞的迁移能力的差异变化情况。5、采用Western blot检测过表达和干扰Samd7的NK细胞以及KK细胞中上皮-间质转化的关键蛋白(N-cadherin和Occludin)表达情况。[结果]1、KK和NK原代细胞成功复苏,Smad 7慢病毒干扰载体转染成功,Smad7慢病毒表达载体转染成功。成功建立下调和上调表达Smad7的NK和KK细胞,采用QPCR检测Samd7基因在KK细胞中筛选最佳干扰并验证表达载体,慢病毒表达载体转染KK细胞后Samd7基因上调(2694.706±900.541)倍,慢病毒干扰载体转染KK细胞后Samd7基因下调(5.993±0.023)倍,(P<0.01)。2、采用QPCR和Western Blot检测在过表达和干扰Samd7的NK细胞以及KK细胞中Samd7和Samd3的表达情况:提示Samd7与Samd3的表达呈负相关。3、用CCK-8检测细胞增殖情况发现:过表达Smad7无论在NK细胞还是在KK细胞中均可抑制其增殖性,而干扰Smad7则能促进细胞的增殖性,且随着培养时间延长,抑制和促进的趋势都愈发明显。4、采用Transwell小室检测过表达和干扰Samd7的NK细胞以及KK细胞迁移能力差异情况:KK细胞各组迁移细胞数均较NK各组细胞更多,符合瘢痕疙瘩的生长超出原始创伤范围的特征。过表达Smad7可抑制NK细胞和KK细胞的迁移能力;干扰Smad7可增强NK细胞和KK细胞的迁移能力;在KK细胞中抑制和促进的趋势更加明显。5、采用流式细胞术检测过表达和干扰Samd7的NK细胞以及KK细胞凋亡差异情况:在正常皮肤角质形成细胞中过表达Smad7可以促进细胞的凋亡,而干扰Smad7可以减缓细胞的凋亡;在瘢痕疙瘩角质形成细胞中,过表达Smad7基因也可促进其凋亡,且促进的效率大于正常皮肤角质形成细胞。6、采用Western blot检测过表达和干扰Samd7的NK细胞以及KK细胞中间质转化关键蛋白表达情况:通过shSmad7慢病毒感染后的NK细胞和KK细胞中上皮细胞标志性蛋白Occludin的表达显著减弱(P<0.01),而间质细胞标志性蛋白N-cadherin表达与Occludin相反。[结论]通过下调Smad7基因在瘢痕疙瘩角质形成细胞中的表达可促进TGF-β介导的上皮-间质转化,使细胞表现出更多间质细胞的特征。上调Smad7基因在瘢痕疙瘩角质形成细胞中的表达可抑制TGF-β介导的上皮-间质转化过程,从而抑制其增殖性、迁移能力并促进细胞凋亡。