类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎症性、组织特异性自身免疫性疾病，发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。有研究显示可能是由于自身性免疫障碍导致免疫系统持续攻击关节组织造成长期慢性炎症。尽管已经证实多种细胞和分子参与了关节的炎症反应和组织破坏，但抗原特异性T细胞的激活始终被认为是RA发生发展的中心环节。T细胞主要是通过细胞间的作用及其分泌的细胞因子在RA的发生发展中发挥作用。CD4~+T细胞作为效应T细胞的重要成分，参与免疫应答的各个阶段，在免疫调节中起关键作用，是细胞免疫的核心和枢纽。目前较为公认的观点是：RA是抗原呈递细胞和CD4~+T细胞作用的结果。随着近年对CD4~+T细胞在RA中的作用研究不断深入，为深化对RA发病机制的了解，拓展治疗RA新思路，寻找新的治疗靶点提供了新的理论与实验依据。本研究在改进CIA小鼠模型的研究基础上，以胶原诱导性关节炎小鼠(CIA)为研究对象，通过对CIA模型小鼠脾脏CD4~+T细胞亚群Th1和Th2细胞在不同疾病发展时期占CD4~+T细胞百分比的变化规律以及小鼠血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α动态观察，进一步阐明CD4~+T细胞在RA疾病的发生发展中的作用，为揭示类风湿性关节炎的发病机制提供实验依据。第一部分C57BL/6小鼠CIA模型建立方法的改进目的：建立稳定的C57BL/6小鼠胶原诱导关节炎（CIA）模型，为进一步进行类风湿关节炎（RA）发病机制及治疗研究奠定基础。方法：1．健康清洁级C57BL/6小鼠100只，随机取20只做正常对照组，其余80只小鼠随机分为4组：常规方法组：CⅡ与FCA等比例混合物免疫动物；卡介苗低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别在CⅡ与FCA等比例混合物中加上卡介苗2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml免疫动物。以各组小鼠AI评分判断模型是否成功。2．病理学观察：加强免疫35天脱颈处死小鼠，除去病变关节的皮毛和多余的皮下组织，保留跖趾关节及趾间关节，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，常规脱水，石蜡包埋，切片。HE染色，显微镜下观察。3．关节影像学观察：于加强免疫49天，钼靶X线机对小鼠踝、足关节拍片，进行影像学检查和分析。4．脾脏的大体观察及脾指数测定:取处死后的小鼠脾脏进行大体观察、称重,计算脾指数并与正常对照组进行比较。结果：1．各组小鼠造模成功率的比较及小鼠疾病发展过程中不同时间点关节炎指数(AI)评分卡介苗低剂量组与中剂量组成模率高于常规方法组(P＜0.01)，但卡介苗低剂量组与中剂量组成模率比较差别无统计学意义。小鼠加强免疫后3d逐渐出现足趾部及踝关节皮肤发红，轻度肿胀等关节炎症状。以低剂量组为例分别于加强免疫3d，7d，10d，12d，14d，21d，28d，35d检测各组小鼠AI评分，CIA模型组小鼠AI值在不同时间点与正常对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)。卡介苗高剂量组动物死亡率达到80%，未作统计。2．关节组织病理学研究与正常对照组相比，模型组小鼠（加强免疫35d）病变关节骨质和软骨组织破坏，滑膜组织增厚，血管新生增多，大量炎症细胞侵润。3．关节影像学检查影像学检查显示病变关节组织畸形，关节间隙变窄，关节面不光滑，骨膜内有新骨形成。4．免疫后小鼠脾脏的变化加强免疫后35d小鼠脾脏体积增大，颜色发黑。脾指数与正常对照组比较均显著增加(P＜0.01)。结论：1．在常规造模方法的基础上按照2.5mg/ml的剂量加入卡介苗可有效增加CIA小鼠模型的成模率。低剂量组与中剂量组成模率比较差别无统计学意义。低剂量组CIA模型小鼠关节炎指数(AI)在加强免疫3d，7d，10d，12d，14d，21d，28d，35d各时间点均高于正常对照组。2．通过关节炎指数及影像学、病理组织学等观察，证明按照改良的造模方法，能够建立比较好的CIA模型。第二部分CIA小鼠脾淋巴细胞Th1与Th2的动态观察目的：探讨CD4~+T细胞Thl和Th2在CIA小鼠模型中的动态变化规律。方法：1．HE染色观察模型鼠关节组织病理学变化情况。2．分析天平称重法测定小鼠脾脏重量并计算其指数。3．应用流式细胞仪检测脾淋巴细胞Th1和Th2的变化情况。4．Flowcytomix法检测小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平。结果：1.加强免疫后7d、14d和35d小鼠膝关节切片HE染色均有不同程度的骨组织和软骨质破坏，滑膜组织增厚，血管新生增多和炎症细胞侵润。2．加强免疫后7d、14d和35d各时间点间脾指数差别无统计学意义(P＞0.05)；模型组三个时间点脾指数均高于正常组，差别有统计学意义(P＜0.01)。3．各时间点脾淋巴细胞Th1和Th2的分化水平加强免疫后7d、14d和35d CD4~+IFN-γ+细胞占CD4~+T细胞百分率均高于正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。且加强免疫后7d，和14d与加强免疫后35d比较差异有统计学意义(P＜0.01)。加强免疫后7d、14d和35d CD4~+IL-4+细胞占CD4~+T细胞百分率与对照组比较差别无统计学意义(P＞0.05)。4．各时间点血清IFN-γ和TNF-α的水平加强免疫后7d、14d、35d各时间点血清IFN-γ均高于正常对照组(P＜0.01)，且呈逐渐下降趋势。TNF-α只在加强免疫后7d高于正常对照组(P＜0.01)。结论：1. Th1细胞在本研究模型制备的时点内一直高于正常组；而Th2细胞与正常组比较差别无统计学意义。2. TNF-α在模型早期处于高水平；而IFN-γ在整个病程中均高于正常水平。