背景和目的: 目前的研究表明类风湿性关节炎(RA)的发病和发展与自身反应性T细胞密切相关。在本课题组以前的研究中应用RT-PCR/SSCP技术分析出，RA动物模型——胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠关节聚集的T细胞以TCR v135.2和TCRv138.2为主。依据已分析出CIA大鼠关节病变部位聚集的优势T细胞克隆型，以及研究表明的热休克蛋白(HSP)兼备防治RA和免疫佐剂的作用，用致病性TCR VD克隆型的基因和结核杆菌HSP70编码的基因，联合构建大鼠TCR vβ5.2-HSP70和TCR vβ8.2-HSP70基因真核表达质粒，并研究此重组DNA疫苗对CIA大鼠的保护性作用。本研究可为进行类风湿性关节炎TCRDNA疫苗的研究提供实验依据，也可为其他T细胞介导的自身免疫病的TCRDNA疫苗的研究提供技术参考。 实验方法及结果： 方法：以本实验室构建的重组质粒pTARGET-TCR vβ5.2和pTARGET-TCRvβ8.2为模板，将结核杆菌HSP70的一段保守序列P111-125设计到引物中，通过PCR的方法得到TCR Vβ5.2-HSP70和TCR vβ8.2-HSP70基因片段，将其插入到真核表达载体pTARGET中，构建重组表达载体pTARGET-TCRVβ5.2/8.2-HSP70，并转化E.coli JM109，经蓝白斑筛选阳性菌落后进行菌落PCR和测序鉴定。大量纯化制备连接方向和序列均正确的重组DNA疫苗pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70、pTARGET-TCR vβ8.2-HSP70和空质粒pTARGET，将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠，采集注射部位股四头肌处的肌肉，用Rr-PCR及免疫组化染色法检测TCR VB5.2/8.2-HSP70基因在注射部位的转录和表达。通过高效真核转染试剂ⅥgoFect介导，将重组质粒转染COS-7细胞中进行瞬时表达，用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。然后观察重组DNA疫苗对CIA的保护效果，包括关节炎指数评分、Eli-spot法测定脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平、ELISA法测定血清中抗C Ⅱ抗体的水平和大鼠后肢足关节的病理学分析等。 结果：测序鉴定证实，TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因已被正确插入到pTARGET载体中，并在肌肉组织和COS-7细胞内检测到重组蛋白的表达。重组DNA疫苗pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70和pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70对CIA大鼠有较好的保护性作用，这两组大鼠跟CIA对照组大鼠相比，关节炎指数下降，炎性细胞因子IFN-γ水平和抗CⅡ抗体水平降低，而抑制性细胞因子IL-4水平升高，且病理学改变较轻。且两种重组质粒联合治疗的效果要比单种重组质粒好。 结论：成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR-Vβ5.2/8.2-HSP70，并在体内外检测到其转录和表达。重组表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2－HSP70和pTARGET-TCR.Vβ8.2-HSP70能明显减轻CIA大鼠的关节炎症状和体征，且二者联合应用效果更佳。