论文部分内容阅读
非酒精性脂肪性肝脏疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由非酒精因素引起的一种慢性肝脏疾病,其主要特征是脂质在肝脏中发生异常积累,并且出现多种组织学的病理变化,如肝脏组织的脂肪变,非酒精性脂肪性肝炎,肝脏纤维化,肝硬化甚至会进一步发展为肝癌。近年来许多关于NAFLD的研究发现II型糖尿病,高血脂,肥胖等背景与脂肪肝有很大程度上的联系。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是蛋氨酸在体内由肝脏代谢所产生的具有多种生物学功能的含硫氨基酸。目前将血浆内的Hcy含量过高(≥15μM)定义为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)。许多与代谢相关的疾病、心血管疾病和免疫性疾病的发生都与HHcy密切相关。临床研究显示,血浆中Hcy的含量水平与NAFLD的发生呈正相关关系。可溶性表氧化物水解酶(Soluble Epoxide Hydrolase,sEH)是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)细胞色素P450代谢通路中的关键酶,可将表氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EET)水解成相应的无活性的二羟-二十碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs),从而减轻EETs的血管扩张和抗炎的保护作用,影响疾病的进展。多种研究显示,Hcy可引发肝脏的脂质代谢紊乱。我们的前期研究也发现sEH可通过增加脂肪组织的炎症参与高脂饮食引起的肝脏脂质沉积;HHcy可通过激活芳香烃受体-CD36信号路径诱导肝脏的脂肪变性。然而HHcy是否通过改变肝脏中sEH的表达而影响肝脏的脂质代谢尚未见报道。本课题的目的在于探讨sEH在HHcy引起的肝脏脂肪变性中的作用及机制,以期为HHcy引起的脂肪肝疾病提供新的治疗靶点。首先,6周C57BL/6小鼠给予2%蛋氨酸饮食(High-methionine diet,HMD)喂养8周,检测血浆Hcy水平显著上升,提示我们成功建立了HHcy小鼠模型。肝脏切片油红O染色和脂质抽提发现HHcy组小鼠肝脏出现明显的脂质沉积。进一步检测肝脏组织中sEH的表达和活性,发现HHcy上调了肝脏组织中sEH的表达和活性,减少了肝脏组织中EET的含量。体外实验结果显示,给予小鼠原代肝细胞Hcy处理引起了肝细胞的脂质沉积,同时上调了肝细胞sEH的表达和活性,降低了细胞内EET的水平。以上结果表明,sEH参与了HHcy诱导的肝脏脂肪变性。为了进一步明确sEH蛋白在HHcy小鼠模型肝脏脂肪变性过程中的影响,给予C57BL/6小鼠HMD饮食喂养4周,之后从第5周起在其饮水中添加sEH抑制剂1-三氟醚甲氧基-3-(1-丙酰苯噻啶-4-烃基)脲(1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl)urea,TPPU)继续喂养4周,发现TPPU明显减轻了HHcy组小鼠肝脏的脂质沉积,同时增加了HHcy组小鼠肝脏组织过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)调控的下游参与脂肪酸氧化的基因Cpt1a,Acox1和Mcad的表达。给予小鼠原代肝细胞Hcy处理同时添加TPPU抑制sEH活性,TPPU显著减少了肝细胞的脂质沉积,增加了Cpt1a,Acox1和Mcad的表达;而敲减PPARα则逆转了TPPU引起的PPARα的激活。进一步的荧光素酶报告基因检测结果显示,TPPU明显增加了过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(Peroxisome proliferator-activated receptor response element,PPRE)的活性,说明sEH的抑制可以激活PPARα。这些结果表明TPPU抑制sEH的活性可通过激活PPARα,促进肝脏的脂质氧化,保护HHcy诱导的肝脏脂肪变性的发生。作为sEH的重要底物,EETs具有重要的心血管保护和抗炎作用。EETs因其结构差异存在四种同分异构体:5,6-;8,9-;11,12-;14,15-EET。不同疾病模型中,发挥作用的EET的种类不同。在本课题的研究中,我们发现HHcy特异性降低了肝脏组织和肝细胞内11,12-EET的水平。而抑制sEH的活性显著增加了11,12-EET的水平。相关研究表明EET是内源性PPARα激活子。为了进一步明确EET是否可直接参与PPARα的激活,我们将原代肝细胞转染PPRE荧光素酶报告基因质粒后分别给予5,6-;8,9-;11,12-;14,15-EET处理,发现11,12-EET明显增加了PPRE的活性。因此,11,12-EET可作为PPARα的内源性激活物参与保护HHcy引起的肝脏脂质沉积。本课题的研究表明,sEH在HHcy引起的肝脏脂肪变性过程中发挥着重要作用。TPPU抑制sEH的活性,增加肝脏内11,12-EET的水平,11,12-EET作为PPARα的内源性激活物激活PPARα,促进肝脏的脂质氧化,减轻HHcy引起的肝脏脂肪变性。TPPU有效减轻HHcy诱导的肝脏脂肪变性,这一发现提示了脂肪肝临床治疗的潜在靶点。