第一部分建立缺血再灌注损伤的糖尿病小鼠心脏模型研究背景:糖尿病显著增加心血管疾病的发生率和死亡率,循证医学证明,约60%糖尿病患者死于心血管相关的并发症。其中,冠心病是最主要死因,而缺血再灌注损伤在冠心病心肌损害过程中发挥重要作用。目前,糖尿病容易致冠心病的具体发病机制不完全清楚。对此,本实验拟通过糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤的模型来探讨相关的发病机制,探索最佳的治疗方案。目的:建立缺血再灌注损伤的糖尿病小鼠心脏模型。方法:(1)实验组小鼠高脂饲料喂养2周后,腹腔内注射链脲佐菌素110mg/kg建立糖尿病小鼠模型,对照组小鼠普通饲料喂养并腹腔内注射同等剂量的柠檬酸钠缓冲液。(2)分别于建模前及建模8周时测定实验组和对照组小鼠感觉神经传导速度,分析糖尿病小鼠神经病变情况。(3)利用Langendorff离体心脏灌流系统评估缺血再灌注损伤对糖尿病小鼠心功能的影响,记录心功能的参数。结果:(1)实验组糖尿病小鼠的血糖水平明显高于对照组(28.81±4.67 vs.8.56±1.64 mmol/L,P<0.01),并维持高水平至实验结束。(2)实验组糖尿病小鼠感觉神经传导速度明显低于对照组(22.22±3.43 vs.31.29±2.48 m/s,P<0.01),提示糖尿病小鼠出现神经性病变。(3)经历缺血再灌注损伤后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、HR、CF均显著下降,LVEDP升高,与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。结论:成功建立糖尿病小鼠模型,诱导出糖尿病神经病变;建立糖尿病小鼠离体心脏Langendorff缺血再灌注损伤模型,为后续实验建立研究基础。第二部分神经生长因子对糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究背景:在糖尿病患者中,由于存在神经病变,因此即使发生了严重的心肌缺血,疼痛症状往往较轻微或不典型,易被误诊或延误病情。神经生长因子(NGF)是一种多肽物质,能够维持交感神经和感觉神经的功能。已有研究证实,神经生长因子可以改善糖尿病大鼠心脏神经功能,降低室性心律失常的发生率。然而,神经生长因子能否改善缺血再灌注损伤的糖尿病小鼠的心脏功能尚无相关研究。目的:将NGF转基因疗法应用于糖尿病合并心肌缺血动物模型,在其改善心脏神经末梢功能的同时,观察缺血心脏的功能改善程度。方法:利用第一部分建立的糖尿病小鼠模型来探索神经生长因子对糖尿病离体心脏缺血再灌注损伤后心功能的改善程度,具体包括:(1)制备表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒(Ad-NGF)。(2)Western Blot实验研究糖尿病小鼠心脏NGF的表达水平。(3)将重组腺病毒(Ad-NGF)转染至心肌组织。(4)建立离体心脏Langendorff灌流体系,观察Ad-NGF对糖尿病离体心脏缺血再灌注损伤后心功能的影响,RM6240生物信号采集系统实时动态监测LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(5)收集复灌期间的灌流液,测定乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:(1)重组腺病毒感染293T细胞后,Western Blot检测到目的基因融合蛋白的表达,说明重组腺病毒构建成功。(2)糖尿病小鼠心肌组织NGF表达显著减少。转染Ad-NGF后,NGF表达升高,说明目的基因成功转染到心肌细胞并且表达提高。(3)与对照小鼠心脏相比,糖尿病小鼠心脏在缺血再灌注后心功能明显下降:LVSP、±dp/dt、CF 降低(P<0.05),LVEDP、LDH 升高(P<0.05)。(4)Ad-NGF转染组心脏在缺血再灌注后心功能得到明显改善,其LVSP、±dp/dt、CF 升高(P<0.05),LVEDP、LDH 降低(P<0.05)。结论:表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒可有效转染至心肌组织,发挥改善糖尿病小鼠离体心脏缺血再灌注损伤后心功能的作用。第三部分TRPV1途径在神经生长因子介导的糖尿病心肌缺血再灌注损伤的保护机制中的作用研究背景:TRPV1受体是已知的位于感觉神经末梢上的感受器,在心脏上有大量表达。已有研究证实,激活TRPV1受体能改善小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心功能。然而,NGF能否通过调节感觉神经TRPV1受体途径改善糖尿病心脏缺血再灌注损伤后的心功能尚不清楚。目的:观察Ad-NGF对糖尿病动物模型心脏感觉神经末梢TRPV1受体及其神经递质CGRP、SP释放的影响,并进一步明确NGF能否通过调节感觉神经TRPV1受体途径改善糖尿病缺血再灌注损伤后的心功能。方法:(1)Western Blot方法研究糖尿病小鼠心脏组织中TRPV1受体的表达情况,并用ELISA法测定心肌组织中CGRP和SP的含量。(2)将重组腺病毒(Ad-NGF)转染至心肌组织。(3)建立离体心脏Langendorff灌流体系,缺血开始前5分钟往灌流液中分别加入选择性CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、选择性SP受体拮抗剂RP67580或选择性TRPV1受体激动剂CAP,观察上述物质对糖尿病离体心脏缺血再灌注损伤后心功能的影响,以RM6240生物信号采集系统实时动态监测LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(4)收集灌流液,ELISA法检测灌流液中CGRP和SP的含量。结果:(1)与非糖尿病组比较,糖尿病组小鼠心肌组织中TRPV1受体表达减少(P<0.05),下游神经递质CGRP及SP的含量下降(P<0.05)。(2)与未转染组相比,Ad-NGF转染组糖尿病小鼠心脏TRPV1受体表达增多(P<0.05),下游神经递质CGRP的合成和释放增加(P<0.05),SP的含量无显著性变化(P>0.05)。(3)离体心脏Langendorff灌流系统加入CGRP8-37处理后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、CF 下降,LVEDP 升高(P<0.05);经 CAP 处理后,LVSP、±dp/dt、CF升高,LVEDP降低(P<0.05);RP67580除降低CF外,对其他心功能指标无明显影响。结论:TRPV1途径参与NGF介导的心脏保护过程,NGF通过上调TRPV1受体表达及下游神经递质CGRP的释放来改善糖尿病离体心脏缺血再灌注损伤后的心功能。