百日咳(Pertussis)是一种因感染百日咳杆菌(Bordetella pertussis)而引起的急性呼吸道传染病。自上世纪中叶,随着疫苗的普遍接种,百日咳的发病率和病死率有了极大的降低,但是在疫苗可预防疾病中,该病仍然是主要的致死因素。据世界卫生组织估计,全球每年约2000万~4000万百日咳病例,每年约40万人死于百日咳,其中95%发生在发展中国家。接种疫苗是预防百日咳传播的有效手段。全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine,wPV)和无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,aPV)是两类已批准的百日咳疫苗。由于wPV有时会产生较严重的局部或系统性副反应,自上世纪80年代开始,逐渐被aPV取代。百日咳疫苗在目标人群中接种率逐年高,2018年这一数据更是高达86%,但是百日咳的发病率从上世纪末至今不但没有显著降低,近年反而呈现了上升趋势。aPV疫苗保护力持续时间(4~7年)显著低于wPV疫苗(5~14年)可能是导致上述现象的原因之一。因此,研发更有效的疫苗可能是上述问题的解决方法之一。细菌外分泌囊泡(Outer membrane vesicles,OMV)是细菌分泌到外环境中的一种膜泡结构,它包含外膜蛋白、脂多糖及核酸等多种物质。由于其独特的结构和丰富的抗原成分,OMV具有良好的免疫原性。基于OMV的B群脑膜炎奈瑟菌疫苗已在古巴、挪威、新西兰等国家广泛使用。现有数据显示,B.pertussis的OMV也具有良好的免疫原性,这为研发基于OMV的百日咳疫苗供了科学理论和实验依据。因此,本论文从B.pertussis发酵液中大规模制备OMV,并对其结构、组分、稳定性、免疫原性及免疫保护力进行了详细的研究。主要工作总结如下:1、利用超速离心和密度梯度离心等方法从B.pertussis发酵液中制备OMV,以产率和制备工艺的复杂程度等为主要考察参数,建立了OMV制备方法。利用透射电子显微镜、冷冻电镜、动态光散射技术、蛋白质定量方法、Western blotting及蛋白质组学等技术方法对OMV进行了结构和组分的表征。结果显示,利用超速离心法从发酵液中制备的OMV呈椭球形,粒径分布在20~300 nm之间(平均粒径为107.8±1.7 nm),这与B.pertussis摇瓶培养上清中制备的OMV类似;OMV含有百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳黏附素等745种蛋白质,分子量在10~368kDa之间;其产率是摇瓶培养的13.4倍。2、利用Balb/c小鼠为动物免疫和攻毒模型,以wPV、aPV(无佐剂)和商品化百白破疫苗(DTaP)为对照,评估了百日咳OMV疫苗的免疫原性和保护力,并探索了疫苗的作用机理。此外,还研究了OMV的佐剂性能。结果显示:(1)三种含OMV的疫苗(OMV、OMV+alum及aPV抗原+OMV)与wPV和DTaP类似,能诱导小鼠产生100%的免疫保护力。(2)含OMV疫苗与wPV类似,诱导小鼠产生的IgG2a和IgG1比值均接近1。(3)含OMV疫苗与wPV类似,诱导小鼠产生的抗原特异性IgG水平和脾细胞产生IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-17A水平显著高于DTaP和aPV组。可见,与wPV类似,含OMV的百日咳疫苗能诱导机体产生较平衡的Th1和Th2免疫应答及较强的Th17免疫应答和体液免疫应答。此外,OMV具有使aPV抗原获得类似wPV的免疫诱导能力,说明OMV具有良好的佐剂性能。3、以OMV结构和组分改变为指标,考察了温度和保存时间等对OMV(360μg/mL,D-PBS溶液)稳定性影响。结果显示:(1)-80℃和-20℃保存5个月,OMV囊泡形态、粒径及zeta电位没有发生显著改变;4℃保存时出现OMV数量减少且大部分呈不规则形状,但平均粒径和zeta电位没有显著改变;37℃保存时发生OMV囊泡结构破坏,出现大量无定型颗粒,zeta电位随保存时间逐渐增大(从-21.77 mV变到-16.70 mV);冻干处理能对OMV结构产生显著影响,随时间延长粒径增大而zeta电位逐渐减小(从-21.77 mV变到-41.30 mV),多分散指数显著增大。(2)4℃和37℃保存的样品,出现总蛋白质浓度上升(5个月时分别为545.46μg/mL和746.70μg/mL),SDS-PAGE蛋白条带特征发生明显改变。综上,本论文建立了一种从B.pertussis发酵液中制备OMV的方法;证明了OMV疫苗具有与wPV类似的诱导小鼠产生免疫保护的能力;初步阐明了OMV疫苗的作用机理;初步获得了OMV的保存条件。这些研究可为进一步研发百日咳OMV疫苗供技术方法、数据参考和理论依据。