龚地弓形虫(Toxoplasma gondii,简称弓形虫)寄生于温血动物和人的有核细胞,是重要的人兽共患病原。在对弓形虫体内及体外研究中均观察到速殖子的凋亡现象,但引发弓形虫凋亡的相关因子和机制尚未见报道。大量研究显示,一类以组氨酸和半胱氨酸为催化位点的半胱氨酸水解酶-Metacaspases在植物、真菌及原虫中具有参与凋亡、调控细胞周期和降解错误折叠蛋白等重要功能。我们利用数据库搜索比对发现弓形虫中存在三个Metacaspases(MCAs),分别命名为TgMCA1、TgMCA2和TgMCA3,三者的功能均未见报道。生物信息学分析发现,MCA1与酿酒酵母同源蛋白YCA1相似性达49%,且具有组氨酸和半胱氨酸组成催化活性位点;MCA2的半胱氨酸相邻的组氨酸和MCA3的组氨酸均有突变。我的博士论文对MCA1和MCA2进行较为系统的研究。我们首先观察了 MCA1的表达和定位,发现弓形虫速殖子能够表达MCA1,其定位于胞内虫体的胞质中;当虫体释放至胞外,MCA1由胞质向胞核转移并最终聚集于虫体胞核;当弓形虫发生分裂时,MCA1定位于子代虫体的内膜复合体。为了进一步研究MCA1的功能,我们利用基因编辑技术构建了弓形虫MCA1基因缺失株(△mca1)和过表达株(mca1-OE)。对不同调控虫株进行比较研究发现,体外培养△mca1的增殖能力与母源株Aku80无明显差异;mca1-OE的增殖能力下降,虫体胞质分裂延迟,推测MCA1可能参与调控虫体分裂。对弓形虫的凋亡进行检测发现,Amca1置于胞外缓冲液4 h时虫体凋亡率为20%,显著低于△ku80株(37%),而mca1-OE凋亡率为54%,证实MCA1参与调节弓形虫凋亡。为了进一步研究弓形虫MCAs的功能,我们对MCA2 展开研究。对构建的TgMCA2内源性标记虫株进行IFA,发现MCA2定位于弓形虫胞质中,未检测到其向虫体胞核转移和与IMC1共定位的情况。利用同源重组技术构建了MCA2基因缺失株(△mca2)及MCA1和MCA2双基因缺失株(△mca1△mca2)。对各基因调控虫株比较研究发现,体外培养的△mca2、△mca1与母源虫株Aku80的分裂增殖无明显差异,而双基因缺失株△mca1Amca2的增殖能力显著下降。经腹腔感染的△ku80、△mca1和Amca2株速殖子的小鼠于感染后6至11天陆续死亡,各虫株对小鼠的致病性差异不显著,感染Amca1△mca2的37%小鼠(9/24)耐过并存活,说明双基因缺失虫株对小鼠的致病性降低。进一步观察细胞培养中各虫株发育和繁殖,发现Amca1和△mca2单一基因缺失时不影响虫体的内二分裂,胞内逸出的速殖子形态正常。双基因缺失株Amca1Amca2的大部分速殖子(61.9%带虫空泡内的速殖子)不能成功分裂出子代虫体,出现多核体现象且子代虫体的内膜复合体表达和定位异常;释放后的大部分虫体在胞外环境变圆,不能保持正常形态。经表面活性剂脱氧胆酸盐提取全虫蛋白,发现双基因缺失虫株△mca1 Amca2的内膜复合体蛋白IMC1比Aku80虫株更易溶解于脱氧胆酸盐中,提示双基因缺失株IMC1的成熟受到抑制,证实弓形虫MCA1和MCA2共同参与虫体IMC1的加工成熟。综上所述,MCA1和MCA2在虫体的生命活动中具有重要功能。MCA1参与弓形虫自身凋亡,其在虫体内的定位随着虫体生命活动发生变化;两种蛋白在虫体分裂过程中共同发挥作用,参与弓形虫二分裂过程中内膜复合体蛋白IMC1的形成;而虫体单一缺失MCA1或MCA2时对子代虫体分裂的影响不显著。