论文部分内容阅读
减数分裂是真核生物进行有性生殖的必经环节,是配子发生的必需过程。在减数分裂过程中,二倍体细胞只进行一次DNA复制但发生两次连续的染色体分离。减数第一次分裂(Meiosis Ⅰ,MⅠ)发生同源染色体分离,减数第二次分裂(Meiosis Ⅱ,MⅡ)发生姊妹染色单体分离,最终产生染色体数目减半的配子。同源重组是减数分裂的核心事件,其产物交叉重组(Crossover,CO)能够建立同源染色体之间的物理连接,保证同源染色体的正确分离;同时交叉重组会引起双亲遗传物质相互交换,增加物种的遗传多样性。同源重组受染色体结构的严格调控。减数分裂染色体被特异的组装成“环-轴”(loop-axis)结构,由一系列染色质环和底部的轴结构组成。染色体轴结构是由轴蛋白以及大量DNA所组成的复杂网络结构。大量的研究表明,交叉重组频率受染色体轴长调控,但染色体轴长调控机制尚未明晰。有丝分裂和减数分裂染色体上的组蛋白都会发生各种翻译后修饰,包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等。这些修饰可能通过改变组蛋白间、组蛋白与DNA间以及DNA与非组蛋白间的相互作用,从而影响染色质的高级结构。其中组蛋白的乙酰化修饰能够中和组蛋白赖氨酸残基的正电荷,使紧密的染色体变得疏松。Esa1是酿酒酵母正常生长所必需的组蛋白乙酰转移酶,是NuA4复合物的催化亚基,可乙酰化组蛋白H4,H2A,H2B和H3。Esa1在有丝分裂DNA复制、DNA损伤修复以及转录调控中都发挥了关键作用。但是,Esa1在减数分裂中的功能以及作用机制均未知。本论文以酿酒酵母为材料,系统的探究了 Esa1在减数分裂,特别是在染色体的结构以及重组过程中的功能和作用机制。主要结果如下:(1)Esa1调控交叉重组频率,是正常减数分裂所必需的。通过Western blot和免疫荧光,我们明确了 Esa1在减数分裂中持续表达且Esa1在减数分裂前期Ⅰ定位在染色质环上。然后我们构建了esa1-md(meiosis-specific depletion of Esa1)菌株,分析敲除Esa1对减数分裂事件的影响。结果显示,与野生型相比,esa1-md菌株完成减数第二次分裂的细胞核比例降低,产孢率、孢子存活率明显降低,染色体错误分离率增加,联会复合体形成缺陷。我们通过检测粗线期染色体上的Zip3(交叉重组标志蛋白)数量,分析Esa1缺失对重组的影响。结果显示esa1-md菌株粗线期染色体上的Zip3数量比野生型减少10%。结合遗传学分析,结果显示esa1-md菌株全基因组水平的交叉重组数量也比野生型减少10%。以上结果表明Esa1是有效形成交叉重组和正常完成减数分裂所必需的。(2)Esa1调节染色体的轴长进而调控交叉重组频率。为了探究Esa1调控交叉重组频率的分子机制,我们对调控交叉重组频率的可能因素,强制性交叉出现频率和交叉干涉强度进行检测。通过比较任意一条染色体上没有Zip3的细胞核比例分析强制性交叉出现频率,结果显示esa1-md任意一条染色体上没有Zip3的细胞核比例与野生型无明显差异。通过并发系数(Coefficientof Coincidence,CoC)曲线和伽马分布的形状参数(gamma)分析交叉干涉强度,结果显示esa1-md菌株CoC曲线和gamma值均与野生型无明显差异。以上结果表明减数分裂特异敲除Esa1,虽然导致了交叉重组频率下降,但强制性交叉出现频率和交叉干涉强度都没有改变。考虑到交叉重组频率主要由染色体轴长调控,因此我们检测了野生型和esa1-md菌株的染色体轴长。无论是通过联会复合体横向纤维Zip1还是通过染色体轴蛋白Rec8标记粗线期的染色体轴长,测量结果都显示esa1-md菌株的染色体轴长明显短于野生型。因此我们得出结论,Esa1调控交叉重组频率是通过调节染色体轴长,而不是通过强制性交叉出现频率和交叉干涉强度的改变。(3)Esa1从减数分裂前期Ⅰ早期开始调控染色体轴长,进而调控DNA双链断裂(DNA double-strandbreak,DSB)和重组中间体产生的数量,最终影响交叉重组频率。为了探究粗线期染色体轴长调控交叉重组频率的机制,我们对粗线期之前的染色体轴长进行分析。我们利用GFP标记4号染色体的端粒和着丝粒,通过测量两个GFP点状信号的距离分析染色体的凝缩程度,以此间接反映染色体轴长变化。结果显示在没有Zip1信号时,esa1-md菌株两点之间的距离与野生型无明显差异;当Zip1信号呈点状、短线和长线状时,esa1-md菌株两点之间的距离明显短于野生型。Zip1信号呈点状、短线和长线状信号分别代表细胞处于细线期、偶线期和粗线期,由此推测Esa1从前期Ⅰ的早期开始调控染色体轴长。我们进一步分析交叉重组产生过程,对从DSB产生到交叉重组形成所需要的关键蛋白进行检测。通过检测组蛋白H3K4me3的水平和RMM(Rec114-Mer2-Mei4)在染色体上的定位分析DSB产生所需蛋白的变化,结果显示esa1-md菌株组蛋白H3K4me3的水平与野生型无明显差异;但是esa1-md菌株中Zip1信号呈点状时,定位到染色体上的Mer2数量明显少于野生型。我们对DSB标志蛋白Rad51和重组中间体标志蛋白Msh4进行检测,结果显示esa1-md菌株染色体上的Rad51和Msh4数量都有同等程度的减少。据此我们推测Esa1缺失导致粗线期之前染色体轴长变短,可能影响了 Mer2/RMM在染色体上的定位,进而使产生的DSB和重组中间体数量减少,最终影响交叉重组频率。(4)Esa1通过调控组蛋白H4乙酰化来调控染色体轴长。已知在有丝分裂中,Esa1可乙酰化组蛋白H4,进而改变染色体结构。为了探究Esa1调控减数分裂染色体轴长的机制,我们对减数分裂中的组蛋白H4氨基端乙酰化水平进行检测。通过免疫荧光和Western blot,结果显示esa1-md菌株组蛋白H4氨基端的乙酰化水平降低。由此推测Esa1可能通过乙酰化组蛋白H4氨基端来调节染色体轴长,所以我们将组蛋白H4氨基端第4-19位氨基酸删除,构建了 hhfN4-19Δ菌株,对其染色体轴长和交叉重组频率进行分析。结果显示hhfN4-19Δ菌株染色体轴长变短,Zip3数量减少。以上结果表明Esa1通过乙酰化组蛋白H4氨基端来调控染色体的轴长。考虑到Esa1在转录过程中的重要作用,利用转录测序分析发现野生型和esa1-md中早期转录水平没有明显变化。因此我们得出结论,Esa1不是通过调控转录过程,而是通过乙酰化组蛋白H4来调控染色体轴长。(5)Esa1调控染色体轴长不依赖Pds5。已知黏连蛋白调节蛋白Pds5以剂量依赖的方式调控减数分裂染色体轴长和交叉重组频率。为了分析Esa1调节减数分裂染色体轴长和交叉重组频率是否与Pds5相关,对esa1-md菌株、pds5-md菌株以及esa1-mdpds5-md菌株的染色体轴长和交叉重组数量进行分析。结果显示esa1-mdpds5-md菌株染色体轴长明显短于两个单突变体,esa1-md pds5-md菌株交叉重组数量明显少于两个单突变体。因此我们推测Esa1和Pds5是通过两条不同的途径共同调控减数分裂的染色体轴长和交叉重组频率。综上所述,Esa1在酿酒酵母减数分裂中具有重要功能。减数分裂特异敲除Esa1导致减数分裂过程异常,包括完成减Ⅱ核分裂比例降低、产孢率降低、孢子存活率降低、联会缺陷、染色体轴长缩短和交叉重组频率降低。减数分裂特异敲除Esa1,导致染色体在前期Ⅰ早期开始就异常凝缩,同时形成DSB的关键蛋白Mer2/RMM在染色体上的定位减少,DSB标志蛋白Rad51数量减少,重组中间体标志蛋白Msh4数量减少。进一步研究发现Esa1通过调控组蛋白H4乙酰化水平影响减数分裂染色体轴长。据此我们提出Esa1调控减数分裂染色体轴长和交叉重组频率的可能机制:Esa1通过乙酰化组蛋白H4,调控染色体轴长,影响DSB复合体,调控DSB产生数量,进而影响交叉重组数量。