已有研究表明不同参数的脉冲电场对恶性肿瘤产生的影响分别为以细胞电穿孔为基础的电穿孔疗法(EPT)[1-2]、以不可逆性电穿孔效应为基础的能量可控性陡脉冲疗法[3-4]、以能诱导细胞凋亡为特点的细胞内处理效应[5-11]。内处理效应是指细胞在场强≥10 kV/cm的ns(纳秒)级陡脉冲作用下出现的一系列与μs(微秒)级陡脉冲诱导细胞膜电穿孔现象和能量可控陡脉冲引起细胞不可逆性电击穿截然不同的细胞反应,表现为核膜穿孔、微核产生、基因表达增强;线粒体穿孔并导致胞内钙离子释放;诱导细胞周期改变等。ns级陡脉冲因其等值频率很高能穿透细胞膜(外膜),使得内膜(包括细胞核、线粒体、内质网等)和细胞信号转导等出现一系列的功能性改变即为内处理效应,为诱导肿瘤细胞发生凋亡提供了可能。本实验小组对纳秒级脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡现象的研究已经全面展开,在前期的离体实验中,纳秒级陡脉冲对离体人卵巢癌细胞诱导凋亡作用[12]的研究已经初具成效。因此本实验拟通过在体实验(动物实验)对纳秒级陡脉冲(陡脉冲与纳秒级脉冲相结合的电场)诱导人黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤凋亡的形态及功能学观察及凋亡机制探讨,进一步为纳秒级陡脉冲应用于妇科肿瘤治疗提供理论及实验依据。第一部分纳秒级陡脉冲对人黑色素瘤细胞裸鼠皮下移植瘤的生长抑制和凋亡电镜观察目的:观察纳秒级陡脉冲对人黑色素瘤细胞裸鼠皮下移植瘤的生长抑制和凋亡电镜观察。方法:采用人黑色素瘤细胞A375种植于裸鼠背部皮下,成瘤后采用参数为300ns、20KV/cm、f=1hz的脉冲电场作用于移植瘤5分钟,每两天处理一次,共处理三次。分别观察处理组和对照组各时相瘤体体积大小变化,计算抑瘤率;电镜观察肿瘤超微结构改变,即形态学变化。结果:陡脉冲治疗组裸鼠肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01),呈明显抑制作用;电镜下出现典型的细胞凋亡改变。结论:纳秒级陡脉冲能明显抑制人黑色素瘤细胞裸鼠皮下移植瘤生长,亦诱导A375细胞凋亡,电镜下获得典型凋亡形态学改变。第二部分纳秒级陡脉冲对人黑色素瘤细胞的诱导凋亡作用及凋亡机制的研究目的:观察纳秒级陡脉冲对人黑色素瘤细胞的诱导凋亡作用、Caspase-3表达的影响及其对细胞内钙离子浓度即[Ca2+]i的影响。方法:采用参数为300ns、20KV/cm、f=1hz的脉冲电场作用于移植瘤5分钟,每两天处理一次,共处理三次。免疫荧光检测caspase -3蛋白表达;TUNEL法检测A375细胞的凋亡率;RT-PCR方法检测caspase -3 mRNA表达;以Fluo-3/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,荧光分光光度计测定Ca2+浓度,检测纳秒级陡脉冲对A375细胞[Ca2+]i的影响。结果:免疫荧光结果为caspase -3蛋白表达处理组比对照组明显增多;TUNEL法测细胞凋亡率结果为处理组与对照组相比细胞凋亡率显著增加;RT-PCR结果为caspase -3mRNA表达处理组比对照组明显增多;荧光分光光度计测量处理组Ca2+浓度显著增加。结论:纳秒级陡脉冲能够诱导A375细胞凋亡,且与对照组相比凋亡率显著增加,导致Caspase-3mRNA和蛋白的表达大幅增多。细胞内钙释放引起的钙离子升高,可能是纳秒级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。