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目的:新生儿窒息在围产儿中有较高的发生率,窒息后使用氧气复苏是最常用的方法。随着对氧的认识不断提高,特别是高浓度氧可致早产儿视网膜病(ROP)及慢性肺部疾病(CLD)等的发生,人们对新生儿出生窒息时是否该用纯氧复苏进行了广泛地讨论,但尚未有定论。二十二碳六烯酸(DHA)属长链多不饱和脂肪酸,对脑和视网膜的发育有十分重要的作用,近年来的研究发现DHA还具有抑制炎症,提高机体抗氧化的作用。本课题的目的旨在通过动物实验研究高氧对窒息新生大鼠肺部的影响及补充DHA的作用,主要做了以下的一些工作:(1).观察母鼠孕期补充DHA的新生大鼠在出生时血浆中脂肪酸的成份与未补充DHA的新生大鼠血浆中脂肪酸成份的差异;(2).观察和比较窒息新生大鼠在高氧复苏时体内的氧化和抗氧化因子的变化及母鼠孕期补充DHA对其的影响;(3).观察和比较窒息新生大鼠在高氧复苏时肺部过氧化物增殖激活受体-γ(PPAR-γ)的变化及补充DHA对其的影响;(4).观察和比较窒息新生大鼠高氧复苏时其肺泡巨噬细胞内纤维肌动蛋白的形态和肌动蛋白表达的变化及补充DHA对其的影响;(5).观察和比较窒息新生大鼠高氧复苏时肺部纤维化的病理改变及补充DHA的作用。
方法:36只成年雌性SD清洁级大鼠分批怀孕,母鼠从怀孕开始随机进入普食组(给予普通饲料)和补充DHA组(补充DHA100mg/天),在新生大鼠出生时随机抽取部分新生鼠在生后24小时内采血,并使用气相色谱仪进行血浆脂肪酸成份的测定。其余幼鼠给予缺氧2h,然后随机进入高氧复苏组和空气氧复苏组。幼鼠在窒息后即刻,复苏1天、复苏3天和复苏7天时分别采血,用比色法检测:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量;用荧光定量PCR方法检测PPAR-γ的表达量;用免疫荧光法检测各组幼鼠在复苏7天时肺泡巨噬细胞内纤维肌动蛋白(F-actin)的形态变化;用免疫沉淀法检测肌动蛋白(actin)的表达量;通过病理检查观察各组幼鼠在复苏3天和7天时肺纤维化的发生率及严重程度。
结果:第一部分:孕期补充DHA组母鼠分娩的新生大鼠血浆中脂肪酸的成份与未补充组幼鼠进行比较,发现补充DHA组幼鼠血浆中二十碳五烯酸(EPA,C20:5)的含量(0.53±0.08%)和二十二碳六烯酸(DHA,C22:6)的含量(17.51±0.39%)显著高于未补充组幼鼠(0.40±0.09%,p<0.01和4.46±0.47%,p<0.01)。第二部分:在高氧和空气氧复苏1天、3天和7天时各组幼鼠血中的SOD值比较,差异均有显著性统计学意义(F=5.932,p<0.01;F=5.571,p<0.01和F=11.68,p<0.01);普食+高氧复苏组幼鼠其血中的SOD值在高氧1天、3天和7天时均显著高于普食+空气氧复苏组幼鼠(p<0.05);补充DHA+高氧复苏组的幼鼠在高氧复苏1天、3天和7天时的SOD值也均显著高于补充DHA+空气氧复苏组幼鼠(p<0.05);补充DHA组幼鼠在高氧复苏7天时的SOD值显著高于普食+高氧复苏组幼鼠(p<0.05)。幼鼠缺氧后在高氧和空气氧复苏1天、3天和7天时各组幼鼠血中MDA值比较,差异也均有显著性统计学意义(F=12.31,p<0.01;F=13.867,p<0.01;F=8.907,p<0.01);普食组幼鼠血中的MDA值在高氧复苏1天、3天和7天时均显著高于普食+空气氧复苏组幼鼠(p<0.05);补充DHA+高氧复苏组幼鼠在高氧复苏1天和3天时的MDA值均显著高于DHA+空气氧复苏组幼鼠(p<0.05);补充DHA组幼鼠血中的MDA值在高氧复苏3天和7天时均显著低于普食+高氧复苏组幼鼠(p<0.05)。幼鼠在窒息后即刻、高氧或空气氧复苏1天、3天和7天时各组GSH-Px的值比较,差异均无统计学意义(F=0.788,p>0.05;F=0.663,p>0.05;F=2.47,p>0.05;F=1.242,p>0.05)。第三部分:各组幼鼠窒息后在高氧或空气氧复苏7天时PPAR-γ表达量的差异有显著性统计学意义(F=3.693,p<0.05);补充DHA+高氧复苏组幼鼠和补充DHA+空气氧复苏组幼鼠的PPAR-γ表达量均显著高于普食+高氧复苏组幼鼠的PPAR-γ表达量(p<0.05);补充DHA+高氧复苏组幼鼠和补充DHA+空气氧复苏组幼鼠的PPAR-γ表达量均显著高于普食+空气氧复苏组幼鼠的PPAR-γ表达量(p<0.05);普食组幼鼠在高氧复苏7天时的PPAR-γ表达量显著低于高氧复苏1天时的PPAR-γ表达量(p<0.05)。第四部分:观察到高氧或空气氧复苏的各组幼鼠肺泡巨噬细胞内的纤维肌动蛋白(F-actin)主要有3种形态:(1).普食+高氧复苏组主要表现为F-actin聚集成多个块状(>2个),肌动蛋白丝分布极不均匀;(2).补充DHA+高氧复苏组F-actin分布尚均匀,仅有少量聚集成块的F-actin(≤2个);(3).普食+空气氧复苏组和补充DHA+空气氧复苏组幼鼠的F-actin表现为,在整个细胞内可见均匀分布的红色呈细短状的肌动蛋白,没有明显的聚集成块。通过较为灵敏的Westernblot实验方法测定高氧和空气氧复苏7天时新生大鼠肺泡巨噬细胞内肌动蛋白(actin)的表达量,发现普食+高氧复苏组的表达量显著高于普食+空气氧复苏组,也高于补充DHA+高氧复苏组和补充DHA+空气氧复苏组幼鼠的肌动蛋白表达量,差异均有显著性统计学意义(p<0.05);补充DHA+高氧复苏组幼鼠的actin表达量虽然高于普食+空气氧复苏组及DHA+空气氧复苏组,但差异比较无统计学意义。第五部分:各组幼鼠的肺病理纤维化程度的比较,窒息后高氧或空气氧复苏3天和7天时的肺纤维化评分在各组间的差异有显著性统计学意义(X2=107.084,p<0.01和X2=127.676,p<0.01)。其中,高氧复苏3天时,普食+高氧复苏组幼鼠其肺病理纤维化评分的中、重度百分比最高(60.4%);普食+空气氧复苏组幼鼠的肺病理纤维化评分其正常的百分比最高(38.5%);普食+高氧复苏组幼鼠的肺病理纤维化发生率在高氧复苏3天和7天时均显著高于普食+空气氧复苏组幼鼠(p<0.01)和补充DHA+高氧复苏组幼鼠(p<0.01);DHA+高氧复苏组幼鼠的肺纤维化发生率与DHA+空气氧复苏组幼鼠比较,在复苏3天时两组的差异无统计学意义,但到复苏7天时DHA+高氧复苏组幼鼠的肺纤维化发生率显著升高(p<0.01)。
结论:(1)母鼠孕期补充DHA能显著增加其出生的新生大鼠血浆中的DHA含量。(2)高氧复苏可刺激新生大鼠体内抗氧化酶(SOD)值的升高,补充DHA组幼鼠其体内SOD值可反应性地升高,显著高于未补充DHA的新生大鼠。窒息新生大鼠在高氧复苏时体内过氧化产物产生增加,补充DHA后能显著降低新生大鼠高氧复苏时过氧化产物的产生。提示在高氧情况下DHA能增加机体的抗氧化酶并能减少过氧化产物的产生。(3)高氧所致的肺部炎性损伤可能与PPAR-γ的下降有关,补充DHA可减少高氧复苏时PPAR-γ表达量的下降,减轻肺部炎性损伤。(4)高氧可引起幼鼠肺泡巨噬细胞内纤维肌动蛋白的聚集,使肌动蛋白丝分布紊乱,DHA可抑制纤维肌动蛋白的聚集,同时可抑制肌动蛋白的新生,对肺泡巨噬细胞的吞噬能力有保护作用。(5)缺氧新生大鼠在高氧复苏时肺部纤维化的发生率显著增加,补充DHA能减少高氧时肺纤维化的发生,保护肺组织的正常功能。