论文部分内容阅读
目的:1.建立临床常见的四种念珠菌血症小鼠模型并进行评价。
2.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对不同小鼠模型血清进行分析,寻找差异多肽峰并建立相应的诊断模型,为念珠菌血症的诊断提供新思路。
3.应用高分辨质谱仪对白色念珠菌所致菌血症小鼠血清进行分析,筛选差异蛋白,采用GO分析及KEGG分析等方法进一步筛选可能的血清蛋白多肽标志物。
方法:1.分别将白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的标准菌株复苏后进行增菌培养,用PBS重悬、牛鲍氏计数板计数,倍比稀释为不同浓度梯度菌液,采用尾静脉注射法注入小鼠体内,以7天为观察周期,每天记录小鼠精神状态及死亡情况,计算半数致死量(LD50)。以1/2LD50分别建立白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等常见念珠菌感染所致菌血症小鼠模型,并通过观察小鼠的体重变化、血常规变化、血培养结果、内脏组织学改变等对所建模型进行评价。
2.将SPF级成年雄性ICR小鼠随机分为对照组和实验组,实验组根据采样时间依次分为1h组、3h组、6h组、12h组、1d组、2d组、4d组和7d组,每组各10只,即对照组10只,实验组共80只。实验组以1/2LD50建模,对照组注射等量PBS缓冲液。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对各实验组及对照组血清进行检测,使用BioExplerer TM软件对得到的血清多肽指纹图谱进行分析,寻找具有显著差异的多肽峰,并以此为依据建立相应的诊断模型。
3.采用非标记(Label free)的相对定量质谱法对白色念珠菌菌血症小鼠血清进行分析,得到差异表达蛋白,进一步,对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析,从而筛选可能的血清标志物。
结果:1.本实验得到的建模浓度分别为白色念珠菌为1×106CFU/ml、近平滑念珠菌为2.6×108CFU/ml、光滑念珠菌为2×108CFU/ml、克柔念珠菌为2.1×108CFU/ml。注射后半小时,各组小鼠出现不同程度的精神萎靡、闭眼、抱团、立毛、活动变缓、饮食减少等症状。白色念珠菌感染组小鼠在7天内体重持续下降,白细胞计数先降后升;其余三组念珠菌感染小鼠在7天内体重及白细胞计数均呈先降后升趋势,最终趋于正常水平;血培养有类酵母型菌落产生,经VITEK-MS质谱鉴定为相应病原菌;内脏大体观可见多个出血灶,组织病理学可见肺组织出血、肺间隔水肿、肺泡扩张;肾小管管腔受损,肾小球轮廓不清晰;肝组织肝窦结构模糊,内皮细胞增大,且肝、肺、肾均有不同程度的炎细胞浸润。
2.收集不同组别血清,经MALDI-TOF MS检测,BioExplorerTM软件分析,对比白色念珠菌感染组和正常对照组,共得到65个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升和下降趋势的多肽各有11个,呈先上升后下降趋势的多肽有21个。组合m/z1100.4、1581.0、3808.0这三个差异多肽峰建立诊断模型,灵敏度为95.24%,特异性为90.63%。
3.比较近平滑念珠菌感染组和正常对照组共得到73个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升趋势的多肽有9个,呈下降趋势的多肽有5个,呈先上升后下降趋势的多肽有12个。组合m/z1433.2、1148.5、4093.5、4522.2、8140.9、8234.6这六个差异多肽峰建立诊断模型,灵敏度为95%,特异性为81.25%。
4.比较光滑念珠菌感染组和正常对照组共得到87个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升和下降趋势的多肽各有3个,呈先上升后下降趋势的多肽有20个。组合m/z1979.8、2925.5、3130.7、4211.1、7860.8、8221.1这六个多肽峰建立诊断模型,灵敏度为97.37%,特异性为81.25%。
5.比较克柔念珠菌感染组和正常对照组共得到74个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈下降趋势的多肽有2个,呈先上升后下降趋势的多肽有21个,呈先下降后上升趋势的多肽有5个。组合m/z1942.0、3113.6、4541.4、8223.6这四个多肽峰建立诊断模型,灵敏度为100%,特异性为84.38%。
6.比较白色念珠菌感染组和近平滑念珠菌感染组,97个多肽峰中有78个具有显著差异,组合m/z2736.9、8091.5、8153.7这三个差异多肽峰建立诊断模型,有98.78%的准确率将白色念珠菌感染和近平滑念珠菌感染区分开来。
7.综合比较白色念珠菌感染组、近平滑念珠菌感染组、光滑念珠菌感染组、克柔念珠菌感染组的血清多肽指纹图谱,发现有2个多肽峰在四个感染组中同时出现,分别为m/z2709.3、8168.0。
8.经Label free相对定量质谱法检测,以实验组和对照组差异倍数大于2或小于0.5、t检验P<0.05为标准,共得到白色念珠菌感染组与正常对照组的差异蛋白103个,其中上调52个,下调51个。GO分析显示有12个蛋白与免疫反应有关,其中甘露糖结合蛋白、干扰素受体2等蛋白有文献报道与病原菌感染机体有关。KEGG分析显示这些蛋白共富集到6条通路,包括补体和凝血级联通路、细胞因子相互作用相关通路等。
结论:1.成功建立了临床常见念珠菌感染所致菌血症小鼠模型,该模型具有容易复制、条件稳定、结果可靠的优点,为念珠菌血症相关毒力因子及耐药性致病性等相关机制提供了研究基础。
2.应用MALDI-TOF MS检测不同组别血清,通过BioExplorerTM软件进行分析可以既便捷又直观的反应各念珠菌血症血清多肽表达情况,得到具有统计学差异的多肽,以此为依据建立诊断模型,其诊断效能优于临床现有常规检测指标,为念珠菌血症的诊断提供了新思路。
3.应用基于质谱的非标记方法对白色念珠菌感染组及对照组小鼠血清进行分析,为其血清标志物的筛查提供了有价值的数据,为后续相关研究提供了方向。
2.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对不同小鼠模型血清进行分析,寻找差异多肽峰并建立相应的诊断模型,为念珠菌血症的诊断提供新思路。
3.应用高分辨质谱仪对白色念珠菌所致菌血症小鼠血清进行分析,筛选差异蛋白,采用GO分析及KEGG分析等方法进一步筛选可能的血清蛋白多肽标志物。
方法:1.分别将白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的标准菌株复苏后进行增菌培养,用PBS重悬、牛鲍氏计数板计数,倍比稀释为不同浓度梯度菌液,采用尾静脉注射法注入小鼠体内,以7天为观察周期,每天记录小鼠精神状态及死亡情况,计算半数致死量(LD50)。以1/2LD50分别建立白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等常见念珠菌感染所致菌血症小鼠模型,并通过观察小鼠的体重变化、血常规变化、血培养结果、内脏组织学改变等对所建模型进行评价。
2.将SPF级成年雄性ICR小鼠随机分为对照组和实验组,实验组根据采样时间依次分为1h组、3h组、6h组、12h组、1d组、2d组、4d组和7d组,每组各10只,即对照组10只,实验组共80只。实验组以1/2LD50建模,对照组注射等量PBS缓冲液。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对各实验组及对照组血清进行检测,使用BioExplerer TM软件对得到的血清多肽指纹图谱进行分析,寻找具有显著差异的多肽峰,并以此为依据建立相应的诊断模型。
3.采用非标记(Label free)的相对定量质谱法对白色念珠菌菌血症小鼠血清进行分析,得到差异表达蛋白,进一步,对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析,从而筛选可能的血清标志物。
结果:1.本实验得到的建模浓度分别为白色念珠菌为1×106CFU/ml、近平滑念珠菌为2.6×108CFU/ml、光滑念珠菌为2×108CFU/ml、克柔念珠菌为2.1×108CFU/ml。注射后半小时,各组小鼠出现不同程度的精神萎靡、闭眼、抱团、立毛、活动变缓、饮食减少等症状。白色念珠菌感染组小鼠在7天内体重持续下降,白细胞计数先降后升;其余三组念珠菌感染小鼠在7天内体重及白细胞计数均呈先降后升趋势,最终趋于正常水平;血培养有类酵母型菌落产生,经VITEK-MS质谱鉴定为相应病原菌;内脏大体观可见多个出血灶,组织病理学可见肺组织出血、肺间隔水肿、肺泡扩张;肾小管管腔受损,肾小球轮廓不清晰;肝组织肝窦结构模糊,内皮细胞增大,且肝、肺、肾均有不同程度的炎细胞浸润。
2.收集不同组别血清,经MALDI-TOF MS检测,BioExplorerTM软件分析,对比白色念珠菌感染组和正常对照组,共得到65个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升和下降趋势的多肽各有11个,呈先上升后下降趋势的多肽有21个。组合m/z1100.4、1581.0、3808.0这三个差异多肽峰建立诊断模型,灵敏度为95.24%,特异性为90.63%。
3.比较近平滑念珠菌感染组和正常对照组共得到73个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升趋势的多肽有9个,呈下降趋势的多肽有5个,呈先上升后下降趋势的多肽有12个。组合m/z1433.2、1148.5、4093.5、4522.2、8140.9、8234.6这六个差异多肽峰建立诊断模型,灵敏度为95%,特异性为81.25%。
4.比较光滑念珠菌感染组和正常对照组共得到87个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈上升和下降趋势的多肽各有3个,呈先上升后下降趋势的多肽有20个。组合m/z1979.8、2925.5、3130.7、4211.1、7860.8、8221.1这六个多肽峰建立诊断模型,灵敏度为97.37%,特异性为81.25%。
5.比较克柔念珠菌感染组和正常对照组共得到74个差异多肽峰,其中,随着感染时间的延长,呈下降趋势的多肽有2个,呈先上升后下降趋势的多肽有21个,呈先下降后上升趋势的多肽有5个。组合m/z1942.0、3113.6、4541.4、8223.6这四个多肽峰建立诊断模型,灵敏度为100%,特异性为84.38%。
6.比较白色念珠菌感染组和近平滑念珠菌感染组,97个多肽峰中有78个具有显著差异,组合m/z2736.9、8091.5、8153.7这三个差异多肽峰建立诊断模型,有98.78%的准确率将白色念珠菌感染和近平滑念珠菌感染区分开来。
7.综合比较白色念珠菌感染组、近平滑念珠菌感染组、光滑念珠菌感染组、克柔念珠菌感染组的血清多肽指纹图谱,发现有2个多肽峰在四个感染组中同时出现,分别为m/z2709.3、8168.0。
8.经Label free相对定量质谱法检测,以实验组和对照组差异倍数大于2或小于0.5、t检验P<0.05为标准,共得到白色念珠菌感染组与正常对照组的差异蛋白103个,其中上调52个,下调51个。GO分析显示有12个蛋白与免疫反应有关,其中甘露糖结合蛋白、干扰素受体2等蛋白有文献报道与病原菌感染机体有关。KEGG分析显示这些蛋白共富集到6条通路,包括补体和凝血级联通路、细胞因子相互作用相关通路等。
结论:1.成功建立了临床常见念珠菌感染所致菌血症小鼠模型,该模型具有容易复制、条件稳定、结果可靠的优点,为念珠菌血症相关毒力因子及耐药性致病性等相关机制提供了研究基础。
2.应用MALDI-TOF MS检测不同组别血清,通过BioExplorerTM软件进行分析可以既便捷又直观的反应各念珠菌血症血清多肽表达情况,得到具有统计学差异的多肽,以此为依据建立诊断模型,其诊断效能优于临床现有常规检测指标,为念珠菌血症的诊断提供了新思路。
3.应用基于质谱的非标记方法对白色念珠菌感染组及对照组小鼠血清进行分析,为其血清标志物的筛查提供了有价值的数据,为后续相关研究提供了方向。