卤醇脱卤酶HheC的固定化研究

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工业酶在工业生产中扮演着重要角色。卤醇脱卤酶HheC是一种从农杆菌Agrobacterium radiobacter AD1中提取的新型工业酶,已有的研究表明该酶具有巨大的工业和医药学应用前景,它既可以催化有毒害的有机卤化物如1,3-二氯-2丙醇降解为低毒性的产物环氧丙烷,又可以催化一些手性药物中间体如(R)-4-氰-3-丁酸酯的合成。但是游离状态的HheC的理化性质不稳定,对酸碱、温度、盐浓度等环境变化十分敏感,极易变性失活。为了提高酶的性能以及应用范围而将固定化酶技术用于酶学研究可极大地提高工业酶的应用范围。  本论文通过采用物理吸附法、物理包埋法以及化学共价结合方法对HheC进行固定化研究,找到了针对HheC较为合适的固定方法。首先采用活化硅胶作为吸附载体进行固定,研究发现该方法虽然操作简便且根据以往报道成功率较高,却不适合HheC的固定,酶蛋白结合到载体上活性大幅丧失;之后应用海藻酸钙法为载体对酶和细胞进行包埋固定,研究优化了经典的方案以适应实际的实验需要,制备的固定化细胞可以成功地提高热稳定性约120倍左右,而且发现固定化之后对2-氯-1-苯基乙醇的对映体选择性仍然较好;但此方法制备的固定化载体稳定性较差,载体良好的吸水性能使其容易膨胀破裂,从而导致内部的酶分子释放到环境中,使固定化失去了意义。之后我们又对共价连接法进行了研究,采用环氧功能载体Relizyme403 S进行固定,通过研究优化和改进了传统的固定化方案,简化了复杂的固定化酶制备工艺,制备的固定化酶可提高其热稳定性至少500倍以上,同时用于共价结合的载体克服了包埋法载体的缺陷,研究表明共价载体的物理刚性极强,在水溶液中以及在空气中都十分稳定,使得HheC在工业上的广泛应用得以实现。
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