论文部分内容阅读
自转基因作物研制成功以来，转基因产业飞速发展，由转基因产品引起的安全性问题备受瞩目，转基因检测技术及其标准物质的研究日显重要。为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状，本研究通过分析转基因作物的分子特征，选取启动子CaMV35S、终止子NOS、标记基因NPTII、水稻内标基因SPS、棉花内标基因fsACP及抗虫基因cry1Ab作为靶标序列，并克隆到pEASY-T3载体上，构建了含cry1Ab、fsACP及含cry1Ab、SPS、fsACP、35S、NOS和NPTII的质粒标准分子。并采用PCR鉴定、酶切、测序等方法验证了所构建质粒的正确性。本研究所构建的质粒标准分子可用于定量转基因水稻及转基因棉花的转基因成分含量，亦可用于检测含cry1Ab、35S、NOS、NPTII的转基因材料。本文中的质粒构建、制备、正确性验证方法可为转基因检测用质粒标准分子的研制提供参照。针对质粒标准分子的定值方法不统一的现状，本文比较了紫外分光光度法、PicoGreen试剂盒法及数字PCR法对质粒标准分子的定值结果。结果表明：数字PCR法对质粒标准分子的定量准确度最高，PicoGreen试剂盒法次之，紫外分光光度法定量准确性较差。本研究优化了转基因检测的PCR及荧光定量PCR体系，分析了质粒标准分子的可替代性，并以Cq值为特性量值对质粒标准分子的重复性、均匀性、均一性、稳定性及特异性进行了检测。结果表明：1）、本文所采用的转基因检测的序列具有良好的序列特异性，所使用的引物及探针亦具有较好的特异性；2）、所构建质粒标准分子的均匀性、均一性及实验重复性均十分良好，符合标准物质候选物的要求；3）、所制备的质粒标准分子溶液可在低温条件（-70℃、-20℃、4℃）下稳定储存3个月以上，不宜高温（20℃和40℃）保存或运输；4）、含较短插入片段的质粒标准分子的稳定性高于含较长插入片段的质粒标准分子；5）、质粒标准分子可较好地替代基因组DNA作为转基因检测用标准品。本研究的重复性、均匀性、均一性、稳定性及可替代性等的分析结果可为质粒标准分子申报国家标准物质提供实验依据，可为质粒标准分子的性状分析及保存环境等相关研究提供实验依据。质粒标准分子的检测灵敏度实验结果表明：本研究的普通PCR体系检测限为50copies/μL，可检测转基因成分含量为0.5%的转基因材料；本研究的qPCR体系检测限为10copies/μL，可检测转基因成分含量为0.5%的转基因材料。转基因成分含量检测的灵敏度达到了各国家最低检测阈值（0.9%）的要求。