论文部分内容阅读
目的:构建携带新型放射增敏剂Dbait的乏氧辐射双诱导的重组质粒-pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait,探讨其乏氧条件下对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用,为Dbait的基因靶向放射增敏治疗提供实验依据。
方法:
1、pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait的构建:(1)提取C57BL/6裸鼠肝组织DNA,PCR法扩增出早反应生长因子(early growth response-1,Egr-1)启动子序列。(2)人工合成HRE增强子序列和Dbait的寡核苷酸片段。(3)双酶切反应,依次将Dbait、Egr-1、HRE片段亚克隆入哺乳动物真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建成具有辐射乏氧双启动子的pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait质粒。
2、pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait对宫颈癌Hela细胞的辐射增敏作用:在常氧和乏氧状态下,pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait与宫颈癌Hela细胞共转染24h,集落形成实验检测细胞存活分数,应用单击多靶模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,通过计算D0、Dq、SF2、α、β、α/β等放射生物学参数,比较常氧和乏氧状态下的辐射增敏比(SER)和氧增强比(OER)。
结果:
1、合成的乏氧诱导增强子HRE、辐射诱导启动子Egr-1、新型放射增敏剂Dbait,测序鉴定结果显示克隆成功。
2、亚克隆方法依次将Dbait、Egr-1、HRE序列插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)中,构建成pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait质粒,双酶切和测序鉴定结果显示质粒构建成功。
3、细胞存活曲线显示:(1)在常氧情况下,Hela细胞的D0、Dq、SF2、α/β值分别为2.50、1.43、0.65、7.41;Hela细胞与pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait质粒共转染后,其D0、Dq、SF2、α/β值分别为1.98、0.93、0.52、11.12,两者的SER为1.26。(2)在乏氧情况下,Hela细胞的D0、Dq、SF2、α/β值分别为2.52、1.47、0.66、7.24,质粒转染组细胞各参数值分别为1.74、、1.46、0.43、15.82,两者之间的SER为1.45。(3)pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait转染组的OER为0.88。
结论:
1、成功构建了携带新型放射增敏剂Dbait的乏氧辐射双诱导的真核表达质粒-pcDNA3.1(+)-HRE-Egr-1-Dbait。
2、辐射条件下,能显著提高该质粒对乏氧Hela细胞的放射敏感性。