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食管癌(carcinoma of the esophagus)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,它严重威胁着人类的健康。全世界每年有20余万人死于食管癌,我国每年死亡达15万人,占据世界食管癌死亡人数的大部分。在我国,食管癌发病率男性居各种恶性肿瘤第四位,女性为第七位,而死亡率男女均居第四位。食管癌的发病率有明显的地区差异,高发地区食管癌的发病率可高达150/10万以上,低发地区则只有3/10万左右。国外以中亚、非洲、法国北部和中南美洲为高发区,我国以太行山地区、秦岭东部地区、大别山区、四川北部地区、闽南和广东潮汕地区、苏北地区为高发区。其中河南林县,食管癌死亡率男性为161.33/10万,女性为102.88/10万,其死亡率居各种恶性肿瘤首位[1]。尽管国内外医学工作者经过几十年的探索实践,在食管癌的防治方面取得很大的成绩,但食管癌的具体发病机制仍然不十分清楚,以手术、化疗、放疗为主的综合治疗手段仍不尽如人意,尤其在药物治疗方面,食管癌对化疗药物敏感性很差,化疗效果有限。食管癌的预后仍较差,虽然早期食管癌术后五年生存率可高达80％-95％,但中晚期病人仅为1096左右,后者也正是临床最多见的[2]。如果能开发出一种新的、效果明显的食管癌化疗药物或者新的辅助化疗药物以减轻化疗副作用,则可有望提高食管癌患者的生存率和生存质量,造福广大食管癌患者。
苦参碱(Matrine MA)是传统中药苦参根提纯的化学单体之一,广泛存在于豆科槐属苦参、苦豆子及广豆根中,在我国有丰富的资源,它是白金雀儿碱(lupanine)的异构体,属于四环的喹诺里西啶类(quinolizidine),分子式:C15H24N2O分子量:248.37,化学结构式如下图。多年来对其大量的药理和临床研究发现,MA具有免疫抑制[3]、抗炎、抗肝纤维化[4]、抗心律失常[5]等多种药理作用。广泛应用于临床各科,具有长效、持久、副作用少等特点,容易为广大患者所接受,新近的研究发现,该药还具有抑制多种肿瘤细胞增殖与诱导其凋亡等生物活性[4,5]。研究证实,MA对肝癌、肺癌、胃癌及前列腺癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用。文献报道,一定浓度的苦参碱在体外可诱导胃腺癌SGC-7901细胞、肺癌A549细胞和肝癌HepG2细胞凋亡,且其诱导凋亡的作用随苦参碱的浓度增加而增加[6]。体外0.8g/L苦参碱处理3d就能明显抑制人肝癌细胞株(HepG2)的增殖,1.5g/L可明显诱导其凋亡[7]。有研究提示苦参碱可克服肿瘤的多药耐药现象,有可能成为一种理想的中药抗肿瘤制剂[8]。还有的学者试图从基因水平来阐述苦参碱对白血病细胞诱导分化作用的机制,认为从中药和天然药物中寻找和提取诱导分化剂来进行肿瘤细胞的诱导分化治疗可能是一种新的抗肿瘤治疗途径[9]。有研究表明,苦参碱可明显抑制肿瘤细胞与内皮细胞粘附后CD44、CD49粘附因子的表达,从而抑制了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附,减少了肿瘤的转移[10]。王涌等[11]订研究发现苦参碱可上调细胞粘附调节基因CARmRNA在人肝癌细胞系Bel-7404中的表达,进而影响细胞信号转导通路,最终降低肿瘤细胞的侵袭转移能力,可能是苦参碱诱导分化的重要机制:另外,对肿瘤细胞周期变化的影响也是苦参碱诱导分化的可能机制之一。林洪生等[12]研究表明,一定浓度苦参碱可明显抑制Tiaml基因的表达,通过这种控作用可以降低肿瘤细胞的粘附和迁移,从而对一些肿瘤的浸润和转移产生一定的抑制作用。虽然苦参碱对肺腺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、白血病细胞的体外抑制作用都有相应的研究,并有部分阐述了一定的分子机制,但是苦参碱对食管癌细胞的抑制作用研究以及分子机制的探讨在国内却并不多见,氧化苦参碱对食管癌细胞的作用研究相对多一些。
本论文以人食管癌细胞株(Eca-109)为研究对象,采用MTT比色法、Hoechst33342染色法以及流式细胞分析来探讨中药提取物苦参碱单体对Eca-109的诱导凋亡和抑制增殖作用。首先采用MTT法分别测定Eca-109经不同浓度苦参碱(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ml)处理24 h和经固定浓度苦参碱(2.0 mg/ml)处理不同时间(0、12、24、36、48 h)后的细胞增殖存活率。结果表明,苦参碱在体外对Eca-109具有明显的存活抑制作用,它们的增殖存活率与苦参碱呈剂量一时间依赖关系。随着苦参碱的浓度增加和处理时间的延长,其对Eca-109的抑制增殖作用越强,细胞增殖存活率越低。为了探讨苦参碱是否具有诱导Eca-109发生凋亡的能力,我们采用Hoechst33342染色后经荧光显微镜观察和Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测相结合的方法,研究证实苦参碱可以有效诱导Eca-109发生凋亡,而且凋亡细胞的数量随苦参碱处理时间和作用浓度的增加而增加,表现出明显的时间-剂量依赖关系。同时,我们还采用PI单染经流式细胞仪检测的方法,研究证实苦参碱可以有效诱导Eca-109发生细胞周期G2期阻滞。
综上所述,本论文的研究结果证实了苦参碱具有抑制Eca-109存活增殖及诱导凋亡发生的能力,以及苦参碱诱导Eca-109发生细胞周期G2期阻滞,表明苦参碱抑制Eca-109细胞增殖以及诱导其发生凋亡的机制可能与其诱导Eca-109发生细胞周期G2期阻滞有关,这为我们研究苦参碱诱导人食管癌细胞株发生凋亡的分子机制提供了一个新的思路和方向。通过这些研究,阐明了苦参碱在体外对Eca-109存活增殖的抑制作用和诱导凋亡作用,通过细胞周期阻滞给我们未来的研究提供了新的思路,从而为其作为抗食管癌药物开发奠定了一定的理论基础。