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禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分别引起白粉病和赤霉病,忝列危害小麦最为严重的病原真菌种类。这两种病菌种群变化和毒性变异频繁,给病害防治带来困难,发掘和利用小麦内在抗病机制日益受到关注。因此,作者克隆了小麦针对白粉病的NBS-LRR类抗病同源基因TaRGA,研究了它调控抗病性的分子机理；用水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) harpin蛋白质Hpa1功能片段Hpal 10-42转化小麦,分析了转基因小麦对白粉病和赤霉病的抗性。1. NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆和表达分析根据抗病基因的保守结构域设计简并引物,从抗白粉病小麦品种南农9918的cDNA中获得了大约540bp的单一条带,克隆后测序结果分为3个不同的contigs,其中contig2受白粉菌诱导后上调表达,与二穗短柄草RPS2基因(XR138584)的同源性最高,含有P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a和HD保守结构域,表明该片段为潜在的抗病候选基因片段,暂命名为TaRGA。接着以contig2为靶序列,利用RACE技术获得了cDNA全长3579 bp的小麦抗病相关基因。该基因包含2760 bp的开放阅读框,编码919个通读的蛋白质氨基酸序列,在GneBank中的登录号为KF725625。基因组分析发现该基因包含2个内含子,其中一个位于编码区,大小为857 bp,另一个位于5’-非翻译区,大小为319 bp。半定量RT-PCR表明TaRGA基因在小麦根、茎、叶和穗部组织中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,同时其表达还受白粉菌接种的诱导；Real-time RT-PCR表明TaRGA在小麦中受水杨酸诱导后表达量增加,属于受水杨酸正调控的诱导表达型基因。2. NBS-LRR类抗病同源基因TaRGA的功能分析利用大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)介导的基因沉默(Virusinduced gene silencing, VIGS)技术和瞬时过表达技术对TaRGA基因的功能进行了初步分析。结果表明TaRGA基因的特异性片段被沉默后发生了不同程度的表型变化,并且组织学观察结果与其表型变化一致。与对照相比,接种白粉菌后,TaRGA基因被沉默的小麦叶片上有少量的新生孢子产生,同时组织学中观察到,在接种白粉菌第5天,被沉默的叶片上虽有细胞坏死出现,但这种坏死反应已不能完全抑制病原菌的生长；TaRGA基因瞬时过表达的小麦叶片接种白粉菌后,出现了比对照更大面积的细胞坏死,而且在侵染位点积累了大量的抗菌相关酚类物质；同时病程相关PR基因的表达在TaRGA沉默植株上得到抑制,而在瞬时过表达叶片上得到促进,这些结果表明TaRGA基因参与了小麦对白粉菌的抗病防卫反应。3.转Hpa110-42小麦的分子鉴定及对白粉病和赤霉病的抗性Hpa1是水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)分泌的一种Harpin蛋白,有促进植物生长、诱导植物抗病性的功能,Hpa1序列10-42氨基酸片段(Hpal 10.42)的活性比全长分子高1.3～7.5倍。因此,作者研究了Hpa110-42在转基因小麦体内表达后对白粉病和赤霉病的影响,评价了转基因小麦的抗病水平与应用潜力。利用基因工程技术构建了Hpa110-42基因的单子叶植物表达载体pAHC25-Ubi:Hpal10-42和pCAMBIA1300-44P2000:Hpa110-42,采用基因枪法将重组质粒转化小麦推广品种扬麦16幼胚愈伤组织,获得了再生植株；通过对转基因小麦的T0-T3代植株进行分子检测,发现转入的Hpa110-42基因已整合到小麦基因组中,并且能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。对转pAHC25-Hpal10-42质粒的9个转基因株系接种白粉菌后发现,与受体扬麦16相比,Hpa110-42表达活性高的转基因小麦植株对白粉病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传。对转pCAMBIA1300-44P2000:Hpa110-42质粒的6个小麦转基因系进行禾谷镰刀菌分离物接种测定,结果表明,Hpa110-42在转基因系T3-T5代呈现稳定表达,转基因系发生赤霉病的程度较之非转基因小麦显著降低,而且转基因系T3-T5代赤霉病降低的趋势一致。另外,转基因系病害减轻的程度,相当于在非转基因小麦上使用杀菌剂的效果。可见,Hpa110-42转基因表达对防治小麦白粉病和赤霉病有很大的应用潜力。