论文部分内容阅读
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖经济动物,在我国广泛分布。盐度是三疣梭子蟹养殖的重要环境因子,目前养殖主要在室外养殖,盐度是三疣梭子蟹养殖中的重要环境因子,由于阴雨天气及大换水等常会导致养殖水体盐度急剧变化,使得三疣梭子蟹产生应激反应,生理代谢紊乱,进而免疫力下降,极易引起疾病的爆发,甚至大量死亡。由于工厂大量建设,养殖面积逐年减少,为改变这种情况,充分利用新开发的大量低盐池塘,黄海所开展了耐低盐新品种选育。但在不同低盐胁迫下对三疣梭子蟹细胞凋亡的研究上还未见报道,因此比较三疣梭子蟹不同生长阶段低盐耐受能力,探讨不同低盐胁迫下凋亡情况的分子机制,并进行分析,对三疣梭子蟹养殖和育种具有重要意义。此外,由于水体环境污染加重,造成其病害也日趋严重,已有研究表明,副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)能导致三疣梭子蟹组织病变甚至死亡。当病原感染后,甲壳类动物细胞凋亡数量在组织中频率上升,从而引起机体产生免疫反应,说明细胞凋亡能发挥作用来应对病毒感染,目前在三疣梭子蟹中尚未见凋亡通路上的报道,研究病原感染对三疣梭子蟹细胞凋亡研究具有指导意义。研究内容包括以下三个部分:一、三疣梭子蟹P53、Apaf-1、Bcl-2基因的克隆及序列分析。P53基因是一种重要的肿瘤抑制基因,1979年首次报道,但随着研究的深入,逐渐发现P53基因起到抑癌基因的功能。P53基因作为一种多功能转录因子,在决定细胞对DNA损伤、缺氧和致癌信号等应激的反应中起着核心作用。P53一旦被激活,就会促进超过150个基因的转录,这些基因涉及诱导细胞凋亡、调节细胞周期、肿瘤抑制、基因组稳定、细胞自噬和DNA修复等。Bcl-2基因是Bcl-2家族中非常重要的基因,该基因的功能是抑制凋亡的发生,Bcl-2家族蛋白主要通过影响线粒体外膜的通透性的改变参与到线粒体的凋亡途径,Bc1-2蛋白通过改变线粒体膜电位的变化调节细胞凋亡,从而抑制细胞凋亡。凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1蛋白),在线粒体介导的凋亡过程中起核心作用,多种信号通路都须先作用于Apaf-1,然后在引发下游的凋亡事件,Apaf-1是发育性程序化细胞死亡的重要组成部分。应用RACE克隆技术获得三疣梭子蟹P53、Apaf-1、Bcl-2基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。结果表明:三疣梭子蟹P53基因全长为cDNA序列全长为1544bp,其中ORF为1314bp,编码437个氨基酸(GenBank NO.MH155954),序列中含有168 bp的5’端非编码区(UTR)和230 bp的3’端UTR,3’端存在多聚腺苷酸Poly A尾。ExPASy ProtParam tool在线软件分析显示,三疣梭子蟹P53基因编码一个由437个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白预测理论等电点为5.47,分子量为49.6 kDa。不稳定系数为51.61,属于不稳定蛋白。三疣梭子蟹Bcl-2基因cDNA序列全长为2015bp,其中ORF为849bp,编码282个氨基酸(GenBank NO.MH155953),序列中含有565bp的5’端非编码区(UTR)和602 bp的3’端UTR,3’端存在多聚腺苷酸Poly A尾.含有Bcl-2结构域和一个跨膜区。三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA序列全长为2032bp,其中ORF为1050bp,共编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统进化分析表明,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性最高为51.27%,表明其在进化上具有一定的保守性。组织表达分布,P53基因在鳃和眼柄中的相对表达量最高,其次为肝胰腺,在心脏中表达水平最低;Bcl-2基因在肌肉中表达量最高,表皮中表达量最低;Apaf-1基因在肝胰腺中表达量最高,表皮中表达量最低。二、三疣梭子蟹盐度胁迫后P53、Bcl-2、Apaf-1基因的功能研究Ⅱ期幼蟹在低盐胁迫下,P53基因的表达在3h上调基因表达,12h到达峰值;Bcl-2基因的表达在呈现出先升高后降低再升高的趋势;Apaf-1基因的表达在3h上调基因表达量,3h后随着时间的推移,表达量呈现出上升的趋势。运用石蜡切片进行低盐胁迫下鳃组织的tunel检测,表明低盐胁迫能使细胞的凋亡率发生变化,80日龄时P53基因在低盐胁迫下鳃组织的表达呈现出先上升后下降的趋势,整体高于对照组,在肝胰腺中P53基因的表达呈现出先下降后上升的趋势;80日龄时Bcl-2基因在低盐胁迫后鳃组织从3h起,一直呈现上升的趋势,在肝胰腺中Bcl-2呈现出先上升后下降的趋势,并在72小时达到对照水平。盐度胁迫后,鳃组织中Apaf-1基因表达量总体呈现出先上升后下降的趋势,盐度11的表达量均低于对照组,在肝胰腺中该基因在20盐度时的表达呈现出先上升后下降的趋势,在12h到达峰值,72h恢复到对照组水平。在11盐度胁迫后,肝胰腺组织中Apaf-1基因表达量发生了明显的变化,在12h到达峰值。利用siRNA干扰技术初步探究三疣梭子蟹P53与Bcl-2、Apaf-1基因之间的功能关系。结果表明,直接注射P53基因设计的siRNA具有较好的干扰效果。P53被干扰后可引起Apaf-1的下调,P53被干扰后可引起Bcl-2的显著上调,由此推测,Apaf-1在对P53的调控过程中起着主导性作用;与此同时,Bcl-2对P53有负反馈调节的作用。Western blot实验验证了P53多克隆抗体的特异性,并且P53蛋白灰度值分析结果与低盐胁迫后表达基本一致,表明参与其反应过程。上述结果表明,P53、Apaf-1和Bcl-2基因在三疣梭子蟹应对环境胁迫过程中可能起着重要作用。三、三疣梭子蟹P53、Apaf-1和Bcl-2基因在病毒与细菌感染后的功能分析分别用白斑综合症病毒(WSSV)、副溶血弧菌对三疣梭子蟹进行感染,用荧光定量RT-PCR检测血细胞和肝胰腺中基因的表达,结果表明:三疣梭子蟹血细胞感染副溶血弧菌后,P53基因表达量呈现先上升后下降的趋势,整体呈上调表达,感染WSSV后,在72h到达峰值;肝胰腺在感染副溶血弧菌后,P53呈现先上升后下降趋势,在12h到达峰值,为对照组的4.27倍,在感染WSSV病毒后,P53在24h到达峰值,为对照组的1.5倍;三疣梭子蟹Bcl-2基因血细胞病原感染后,三疣梭子蟹血细胞病原感染后,副溶血弧菌的表达显著低于对照组,WSSV基因表达在24h到达峰值,此时为对照组的1.58倍,肝胰腺在感染副溶血弧菌后,Bcl-2整体呈上调表达。在3h到达峰值,为对照组的6.36倍,在感染WSSV病毒后,在48h到达峰值,为对照组的5.92倍,整体呈上调表达;三疣梭子蟹血细胞感染副溶血弧菌和WSSV病毒后,前者在48h到达峰值,为对照组的2.76倍,后者12h到达峰值,为对照组的1.25倍。肝胰腺在感染副溶血弧菌后,Apaf-1在72h到达峰值,为对照组的5.44倍,在感染WSSV病毒后,Apaf-1呈现出先上升后下降的趋势,在12h到达峰值,为对照组的5.89倍。Western blot实验验证了P53蛋白灰度值分析结果跟病原感染后表达基本一致。由此推论,P53、Bcl-2和Apaf-1基因参与了三疣梭子蟹的免疫防御过程。推测该基因在三疣梭子蟹低盐诱导和先天免疫过程中发挥重要功能,为三疣梭子蟹和其他甲壳动物的凋亡通路的研究提供了理论指导。