泛素化是真核生物中最重要的翻译后修饰之一。泛素化过程除了参与蛋白酶体降解之外,还参与调节许多生物学过程,包括细胞内转运,DNA修复,信号传导和蛋白质蛋白质相互作用。泛素化过程通过多步酶促级联反应实现。在这一过程中,泛素连接酶(E3)决定了泛素化底物识别的特异性。然而多数E3的底物尚不清楚。鉴定这些底物是当前泛素化研究的主要难点。目前,多数底物的是在不同实验室用不同的方法逐一鉴定出来的,需要更好,更快,更经济的高通量方法鉴定E3底物。目前已经有几种高通量研究E3底物的方法,包括,1.利用蛋白质芯片作为底物高效筛选E3底物；2.体内(in vivo)非标记定量或SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acid)标记定量质谱的方法；3.体内GPSP (Global Proteins Stability profiling)的方法。在本研究中,我们建立了与上述方法不同的两种较高通量鉴定泛素连接酶底物的新策略。许多E3特异性识别底物是通过他们的蛋白质相互作用结构域实现的,在本论文的前一部分,我们建立了一套在蛋白质组水平上系统鉴定含蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶底物的策略(见图1)。本策略通过筛选随机多肽文库鉴定蛋白质相互作用结构域的配体结合特性。通过构建了一系列人工底物(artificial degron),包括一个可以被泛素化的序列和一系列识别底物的序列用于体外泛素化实验。通过这一策略,除了底物之外还能鉴定到非底物调节蛋白。该策略还能鉴定到底物识别的详细机制,这对于药物的研发很有帮助。本课题中以LNX (Ligand of Numb protein X)家族E3(一组含有PDZ结构域的RING-type泛素连接酶)为例,来阐述和验证这一策略。我们鉴定到大量LNX1的潜在底物；在选出的9个候选底物中,8个在体外泛素化实验中被LNX1泛素化。在进一步的细胞内验证中,本研究验证出两个LNX1内源底物—-PBK和BCR。进一步实验证明LNX1催化PBK的泛素化和降解,抑制细胞增殖,促进阿霉素诱导的细胞死亡。我们还描述了LNX1识别底物的详细机制,即LNX1通过哪个PDZ结合底物。这一策略作为一个在蛋白质组水平上系统鉴定E3底物的有力工具,能够扩展到其他含有蛋白质相互作用结构域的泛素连接酶的研究。在本文的后一部分,我们建立了另一套较高通量鉴定E3底物的新策略(见图2)。该策略利用活噬菌体展示文库做为E3底物进行筛选。本研究以MDM2为例阐述和验证该策略。通过4次不同方法的筛选,本策略鉴定到MDM2的16个天然潜在底物和许多非天然潜在底物。有些底物可以在不同的实验中重复筛选到。在选出的12个候选底物中,10个在体外泛素化体系中被MDM2泛素化。在进一步的细胞内验证中,本实验验证出三个MDM2的新底物蛋白——DX42,TP53RK和RPL36a。进一步的研究发现了MDM2促进TP53RK泛素化导致其被蛋白酶体的降解。在本策略中,除了多聚底物之外,还能鉴定到更多的MDM2单泛素化或寡聚泛素化底物。只要某一个E3适合体外泛素化系统,且不泛素化空噬菌体,这一策略就能够推广到该泛素连接酶底物的筛选中。