研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),俗称“冰毒”,是一种目前泛滥全球的具有较高依赖性、成瘾性的中枢神经类兴奋剂。我国也是甲基苯丙胺泛滥的重灾区,吸食冰毒人数逐年上涨,吸食人群甚至呈现出低龄化趋势,这一情况严重威胁着公共安全和社会秩序。在我们法医的工作中遇到的因滥用冰毒而引发的刑事案件也屡见不鲜,其致幻作用可能引起各类刑事犯罪,不仅如此,过量吸食导致的中毒死亡及长期滥用的毒性作用更严重影响着人身健康和生命安全。因此,甲基苯丙胺本身的直接毒性作用是当今的研究热点,其毒性机制虽尚未完全清楚,但目前的研究表明,甲基苯丙胺主要具有神经毒性和心血管毒性,其中,氧化应激、线粒体功能障碍、神经元凋亡、胶质细胞活化等是神经系统毒性的研究重点;而心血管系统毒性则主要表现在心肌细胞凋亡导致的严重心血管系统疾病方面。除神经毒性和心血管系统毒性等直接毒性作用外,甲基苯丙胺还可以直接作用于血脑屏障,从而对神经系统进一步产生毒性作用。血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)是维持中枢神经系统内环境稳态的重要结构之一,由毛细血管内皮细胞及其中的紧密连接蛋白、星型胶质细胞足突、周细胞、细胞外基质、基膜等共同组成,是控制血与脑之间物质交换的重要屏障,维持中枢神经系统的内环境稳态。而METH分子量小,具有脂溶性,因此极易通过血脑屏障进入神经系统,产生直接神经毒性的同时影响其内环境稳态,进一步发挥对神经系统的毒性作用,从而损伤神经系统。因此,METH对血脑屏障的影响成为了近年来国内外的热门研究课题。目前研究表明,METH可通过多途径、多机制、多信号通路调控血脑屏障结构中紧密连接蛋白的表达和排布,破坏血脑屏障的结构完整性,使其通透性增加。在血-肿瘤屏障开放的相关研究中,RhoA/ROCK信号通路的调控作用引起了我们的注意。Rho蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员之一,是一组分子量大约为20-25kDa的三磷酸鸟苷(GTP,guanosine-triphophate)蛋白,具有GTP酶活性。目前为止,RhoGTP酶家族已发现约20名成员,分为五个亚家族,包括Rho亚家族、Rac亚家族、Cdc42亚家族、Rnd亚家族和RhoBTB亚家族,其中,Rho亚家族中的RhoA、Rac亚家族中的Rac1和Cdc42亚家族中的Cdc42在多种细胞中均有表达,参与细胞形态的调节,调控细胞骨架重组,在肿瘤细胞侵袭这一研究领域成为研究热点。而肿瘤侵袭中涉及血-肿瘤屏障(Blood tumor barrier,BTB)与本课题组的研究对象BBB有着相似的结构组成,且RhoGTP中的RhoA参与BBB通透性的调控也有报道。RhoA相关信号通路中的下游信号分子包括 Rho 激酶(Rho associated kinase,ROCK)、citron 和 citron激酶、mDial、蛋白激酶N(PKN)、蛋白激酶C相关激酶(PRKs)等,ROCK是研究最多的热门分子。胞质附着蛋白Zona occludens家族中的ZO-1和跨膜蛋白Occludin及Claudin-5是血脑屏障紧密连接(Tight junction,TJ)的主要组成成分,也是研究血脑屏障结构及功能变化的重要指标。而RhoA、ROCK信号分子本身不仅可以直接调控紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的分布及表达,还可以通过磷酸化cofilin及肌球蛋白轻链(myosin light chains,MLC),促进加速肌动蛋白的聚集和解聚过程,使细胞骨架(肌动蛋白微丝,F-actin)收缩,进一步改变紧密连接结构,使其功能发生改变。目前研究认为,METH对血脑屏障通透性的改变作用与METH对神经系统的直接毒性作用机制相似,炎症反应、氧化应激等机制均有可能参与METH对血脑屏障的结构完整性破坏。本课题拟分别建立体内动物模型和体外细胞模型,对血脑屏障在METH作用下的通透性变化进行探究,并进一步验证RhoA/ROCK信号通路在其中发挥的作用。体内实验模型主要采用亚急性METH中毒的SD大鼠模型,而体外细胞模型则是以SD大鼠脑血管内皮细胞(Rat brain microvascular endothelial cell,RBMEC)为主构建的血脑屏障模型。运用形态学观察,功能学检测及定量分析对紧密连接蛋白及信号通路中的信号分子蛋白进行测定。除此以外,运用RhoA和ROCK特异性抑制剂对目标蛋白表达进行抑制,探究RhoA、ROCK及其下游信号分子的变化以及对血脑屏障通透性的影响。综上技术路线,探讨METH对血脑屏障开放的介导作用,初步证明RhoA/ROCK在调控血脑屏障通透性中的作用,完善METH的神经毒性在神经系统内环境中作用的理论基础。血脑屏障功能障碍作为许多神经系统疾病的共同病理学表现,揭示其损伤机制是研究众多神经系统疾病的新道路。目的:分别建立体外细胞模型和体内动物模型模拟METH中毒,通过分子生物学技术、形态学观察、功能学实验验证METH对血脑屏障的开放作用及RhoA/ROCK的调控角色,通过特异性抑制剂抑制上游信号分子的表达再次验证RhoA/ROCK的调控作用,为甲基苯丙胺对中枢神经系统内环境的毒性作用提供理论依据,并为药物靶向治疗提供可能性。方法:1.METH导致的血脑屏障中毒体外细胞模型的建立(1)15%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,37℃和5%CO2条件下原代培养SD大鼠乳鼠的脑血管内皮细胞,传代至96孔板中,待细胞密度达到 80%-85%时,分别使用 Ommol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L、1.6 mmol/L、2.0 mmol/L、2.4 mmol/L、2.8 mmol/L、3.2 mmol/L。3.6mmol/LMETH 的 2%FBS 的 DMEM 培养基培养 6 小时后,CCK-8法测定不同浓度METH处理后的脑血管内皮细胞的LC25,LC50。(2)将脑血管内皮细胞传代至六孔板中,待细胞密度达到80%-85%时,按照 0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L浓度梯度的METH对细胞进行处理并放入孵箱继续培养6小时,提取总细胞蛋后运用Western Blot检测紧密连接蛋白、MMP-9在不同浓度METH处理后的变化情况,以此选取最适浓度建立细胞中毒模型。(3)根据上述实验结果,选取最适METH浓度建立细胞中毒模型,按照0小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时的时间梯度进行处理,提取总细胞蛋白进行Western Blot检测不同时长处理条件下的紧密连接蛋白、MMP-9的表达情况,以选取中毒模型的最适处理时间。(4)将脑血管内皮细胞传代接种于Transwell小室中,在上述实验结果的基础上,按照最适浓度和最适时间给予METH进行处理,选取Lucifer Yellow作为示踪剂检测体外BBB模型的通透性。(5)将传代细胞接种于共聚焦培养皿中,METH处理后进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜下观察F-actin的表达及分布情况。2.RhoA/ROCK信号通路的调控角色(1)建立METH中毒的细胞模型,Western Blot检测RhoA/ROCK信号通路中相关信号分子的表达情况并与空白对照组进行比较。(2)选取RhoA特异性抑制剂C3 Exoenzyme和ROCK特异性抑制剂Y-27632对细胞进行预处理。我们将细胞分为空白对照组(Ctrl)、给药组(METH)、Y-27632单独处理组(Y)、C3 Exoenzyme单独处理组(C3)、给药+Y-27632 组(METH+Y)、给药+C3 Exoenzyme 组(METH+C3)。给予相应药物处理后收集细胞蛋白检测RhoA/ROCK信号通路中相关信号分子的表达情况。(3)对上述各组细胞进行功能学实验检测,利用Lucifer Yellow作为示踪剂来检测通透率的变化情况。(4)将细胞传代接种于共聚焦培养皿中,METH处理后进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜下观察F-actin和ZO-1的表达及分布情况。3.血脑屏障通透性在亚急性METH中毒大鼠模型中的变化及RhoA/ROCK信号通路的参与作用(1)亚急性METH中毒大鼠模型的建立。(2)通过大鼠尾静脉注射示踪剂Evans blue,甲酰胺法测定脑组织内Evans Blue含量,判定血脑屏障完整性及通透性的变化情况。(3)选取海马脑区脑组织进行固定,进行冰冻切片和免疫荧光染色,观察组织结构的变化及F-actin、ZO-1的分布、表达情况。(4)Western-blot检测给予METH处理后海马内紧密连接蛋白、MMP-9和RhoA/ROCK信号通路中相关信号分子表达变化。结果:1.METH导致的血脑屏障中毒体外细胞模型的建立(1)脑血管内皮细胞随METH浓度升高存活率逐渐降低,CCK-8实验结果显示,LC25 和 LC50 分别为 1.63mmol/L 和 3.62mmol/L。(2)按照 0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L浓度梯度的METH对细胞进行处理后,Western Blot检测显示,随着METH浓度增高,紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-5、ZO-1表达量逐渐降低,MMP-9表达量逐渐升高,其中,Occludin和Claudin-5表达量在1.5mmol/L时较Ommol/L的对照组降低50%,MMP-9表达量在1.5mmol/L时较Ommol/L的对照组升高最为明显。(3)按照0小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时的时间梯度,给予1.5mmol/LMETH进行处理,Western Blot检测不同时长处理条件下的紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5、ZO-1表达量随时间的延长先逐渐降低,后逐渐升高;MMP-9表达量随时间的延长先逐渐升高后逐渐降低。其中,处理时间4-6小时之间Occludin和Claudin-5和ZO-1下降约50%,MMP-9升高约1.5倍。(4)Transwell小室培养单层脑血管内皮细胞,Lucifer Yellow作为示踪剂检测通透性,METH处理组Lucifer Yellow的通透率较空白对照组增高。(5)免疫荧光染色镜下可见METH处理组细胞中,主要分布于细胞边缘的F-actin发生向胞质转移的现象,连续分布中断,同时可见应力纤维产生;ZO-1也向胞质聚集,连续分布状态变为不连续状态,且表达量降低。2.RhoA/ROCK参与调控血脑屏障开放的调控作用(1)Western Blot结果显示,与空白对照组相比,METH处理组细胞内RhoA和ROCK表达量升高约2倍,细胞内总MLC、cofilin表达量升高,磷酸化的MLC和cofilin表达量升高约2倍,与RhoA/ROCK信号通路相关联的PI3K和PKB表达量也相应增高。(2)使用特异性抑制剂抑制RhoA和ROCK的表达,各组细胞经相应处理后,Western Blot检测RhoA/ROCK信号通路中信号分子的表达情况,METH处理组与空白对照组相比,METH组内信号分子表达量升高,而 METH+C3 Exoenzyme 组和 METH+Y-27632 组与其相比,METH 对RhoA/ROCK信号通路中信号分子的上调作用被抑制,即RhoA、ROCK、MLC、cofilin以及磷酸化的MLC和cofilin均有所下降。(3)Transwell培养脑血管内皮细胞并按相应分组进行处理,METH组Lucifer Yellow通透率增高,加入抑制剂组其升高效应被抑制。3.亚急性METH中毒大鼠模型中血脑屏障通透性升高,RhoA/ROCK信号通路参与调节血脑屏障的开放(1)亚急性METH中毒大鼠模型构建成功,Evans Blue示踪剂尾静脉结果显示,脑组织中EB含量增加,提示血脑屏障完整性被破坏。(2)免疫荧光染色结果显示,脑血管内皮细胞排列疏松,细胞骨架蛋白F-actin由呈环状分布于细胞边缘转移到细胞质中,集中分布在细胞中央,同时伴有应力纤维生成。(3)提取海马组织总蛋白,Western Blot检测结果显示,METH处理后,紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达下调,基质金属蛋白酶MMP-9表达量上调;RhoA/ROCK信号通路中,上游信号分子RhoA、ROCK表达明显上调,其下游MLC、cofilin表达增加,同时P-MLC、P-Cofilin也出现了表达量上升,趋势一致;除此以外,与RhoA/ROCK信号通路形成交叉的PI3K/PKB信号通路,PI3K和PKB也发生了相应的升高。结论:1.METH可导致脑血管内皮细胞内紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5显著下调,MMP-9显著上调,RhoA/ROCK信号通路中,RhoA、ROCK、MLC、Cofilin、磷酸化的MLC和Cofilin、PKB、PI3K信号分子均显著上调。RhoA或ROCK经特异性抑制剂抑制表达后,ZO-1和Occludin和Claudin-5 上调,RhoA、ROCK、总 MLC、总 cofilin、磷酸化的 MLC 和cofilin、PKB、PI3K信号分子表达量均明显下降。2.METH处理后的脑血管内皮细胞紧密连接遭到破坏,细胞间通透率明显增加。经抑制剂处理后,紧密连接逐渐恢复,通透率降低。3.METH可导致脑血管内皮细胞内F-actin、ZO-1由细胞边缘向胞质转移,表达量下降,同时伴有应力纤维生成。加入抑制剂后,F-actin、ZO-1转移分布减少,应力纤维生成减少。4.METH处理后,Evans Blue示踪剂尾静脉注射结果表明血脑屏障完整性遭到破坏,血脑屏障开放,通透性增高。5.在METH处理后的SD大鼠海马脑区脑组织中ZO-1和Occludin和Claudin-5显著下调,MMP-9显著上调,RhoA/ROCK信号通路中,RhoA、ROCK、MLC、Cofilin、磷酸化的MLC和Cofilin、PKB、PI3K信号分子均显著上调。