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禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病,CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病,给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂多样,在APEC中最常见的血清型是O1、O2和O78。本研究旨在研究气杆菌素家族的iucD基因以及功能未知基因ftsk与致病性之间的关系,了解iucD与ftsk突变株的生物学特性,为深入研究该病的致病机理和特异防制措施奠定基础。1.禽病原性大肠杆菌E058株iucD基因突变株的构建及其治病性的研究运用等位基因交换的方法构建iucD的基因缺失突变株。PCR扩增iucD基因并将其插入到pBSK载体的多克隆位点中,再运用分子克隆的方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因iucD中,构建出带Zeocin抗性基因标志的载体pSK-iucD-Zeo,通过PCR扩增片段iucD-Zeo,并电转化入禽病原性大肠杆菌分离株E058中,根据同源重组原理,筛选出E058突变株E058iucD。Southern blot的结果显示Zeocin抗性基因在E058基因组或质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明突变株的iucD基因不能转录,而其上下游基因的转录未受到影响;E058iucD株较E058株在生长速度上几乎没有差别;在血清杀菌性实验中,突变株对SPF鸡血清比野生株敏感;体内外竞争实验结果表明,E058iucD株对E058株竞争力很弱;E058和E058iucD株的半数致死量(LD50)为分别为105.5 CFU和106.5 CFU;在35日龄SPF鸡的致死性试验中,E058株所致死亡率为50%,而E058iucD突变株所致死亡率为16.5%(p<0.05);12日龄的SPF鸡胚的致死性实验结果表明,E058组死亡率为60%,而E058iucD组死亡率为35%(p<0.05)。上述结果揭示,iucD基因编码的IucD与APEC E058株的致病性有关。2.禽病原性大肠杆菌E058株ftsk基因突变株的构建及其致病性研究运用基因重组的方法将卡那霉素抗性基因(kan)连接到PCR扩增的ftsk两端区域的2个基因片段之间,再插入到pBSK载体的多克隆位点中,构建出带kan基因标志的载体pSK-F2-Kan-F1,通过PCR扩增F2-Kan-F1片段,电转化APEC分离株E058,根据同源重组原理,筛选出APEC E058 ftsk基因缺失突变株E058ftsk。Southern blot结果显示kan抗性基因片段在E058全基因组或质粒中的插入并不是单拷贝的,而是插入了两个拷贝;RT-PCR结果表明突变株的ftsk基因已经不能反转录,而其上下游基因并未受到影响;生长曲线测定结果显示,E058ftsk的生长速度低于亲本株E058;动物实验结果表明E058ftsk在攻毒后6、12和24 h时血液、肝脏、脾脏和肺中的细菌数显著少于APEC E058株。APEC E058株感染组在接种48 h后,除扑杀鸡外,接种鸡全部死亡;而E058ftsk组相应的死亡率为20%左右。因此,可以认定ftsk为APEC E058株的毒力基因之一。