[背景]糖尿病血管病变是糖尿病患者致残致死的主要原因,目前对高血糖引起糖尿病血管病变的机制还不十分清楚。血管内皮细胞衬覆于血管内壁,直接影响血管壁的稳定及功能健全。有研究显示,体外高糖环境可以诱导血管内皮细胞凋亡,血管内皮细胞过多凋亡破坏内皮完整性及功能,是糖尿病血管病变发生发展的关键因素,表明血管内皮细胞凋亡与糖尿病血管并发症密切相关。结节性硬化症复合体-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(TSC-mTORC1)信号通路调节细胞凋亡,亦可能在糖尿病血管并发症中起重要作用。护骨素是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,因可抑制破骨细胞分化和功能上调骨密度而得名。国内外临床研究发现,糖尿病患者体内护骨素水平显著增高,与糖尿病血管并发症及血管内皮功能异常密切相关。一种观点认为,临床研究得出的结果“病变越重,护骨素水平越高”比较直观地反映护骨素可能是血管病变的危险因素；另一种更为普遍接受的观点是,血管病变护骨素水平的升高是机体一种代偿性的防御机制,可避免血管进一步受损,因此也有学者将护骨素称为“血管保护素”。然而,护骨素对高糖环境人血管内皮细胞的作用及机制仍不清楚。[目的]本研究通过体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤,建立人脐静脉内皮细胞的高糖损伤模型,探讨护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制,旨在为护骨素在未来防治糖尿病血管病变等方面的应用研究提供实验依据。[方法]1、体外人脐静脉内皮细胞高糖损伤模型的建立体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为2组：①正糖对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol／L)；②高糖组(葡萄糖终浓度分别为11mmol／L、22mmol／L、33mmo1／L、44mmol／L)。用相应的条件培养液培养不同时间(24h、48h、72h、96h)后收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖率；流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期分布。2、护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制实验1分为4组：①正糖对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol／L)；②高糖组(葡萄糖终浓度为33mmol／L)；③高糖+护骨素组(0.5、1、2μg／mL护骨素分别预培养24h,加33mmol／L葡萄糖)；④高渗对照组(5.5mmol／L葡萄糖+27.5mmol／L甘露醇)。加入相应的培养液培养48h后收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率；Hoechst33258染色观察细胞核形态变化；并用倒置相差显微镜观察24h划痕实验各组细胞的迁移力。实验2分为4组：①正糖对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol／L)；②高糖组(葡萄糖终浓度为33mmo1／L)；③高糖+护骨素组(2μg／mL护骨素预培养24h,加33mmol／L葡萄糖)；④高糖+雷帕霉素组(10ng／mL雷帕霉素预培养24h,加33mmol／L葡萄糖)。加入相应的培养液培养48h后收集细胞,Western blot检测Tuberin、P-Tuberin、S6K、P-S6K、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。3、统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行分析,数据资料用均数±标准差(x±s)表示。组间均数比较采用方差分析,组间两两比较采用Bonferroni法,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1、体外人脐静脉内皮细胞高糖损伤模型的建立1)倒置相差显微镜下观察体外正糖培养人脐静脉内皮细胞形态学变化人脐静脉内皮细胞在4h时可见部分细胞贴壁,伸出伪足；24h时,细胞完全贴壁,并呈单层排列,边界清楚,为圆形、短梭形或扁平多角形；3-4d融合成单层,如铺路石镶嵌排列,有些细胞则呈鱼贯状相连,间有旋涡状排列；5～6d细胞生长融合成致密单层,细胞生长缓慢。2)台盼蓝排斥实验检测每次实验前细胞活力正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。人脐静脉内皮细胞存活率>95%。3)MTT比色法绘制体外正糖培养人脐静脉内皮细胞生长曲线人脐静脉内皮细胞接种后第1d,细胞较接种时无明显变化,此时细胞仍处于滞留期,第2d则明显增加,第3～5d增长迅速,达到其生长高峰,此时细胞处于对数生长期,第6d细胞生长稳定,处于生长平台期。4)MTT比色法检测高糖对人脐静脉内皮细胞增殖的影响正糖对照组(5.5mmol／L葡萄糖)细胞从24h～72h持续增殖,培养至96h细胞光密度值(OD值)降低。11mmol／L、22mmol／L高糖组细胞OD值在24h～96h内随培养时间的延长逐渐增高,但24h～72h两组细胞OD值的增长均低于同时间点正糖对照组,细胞增殖速度慢,融合延迟。33mmol／L、44mmol／L高糖组细胞OD值在24h～96h内随培养时间的延长逐渐降低,两组细胞OD值均显著低于同时间点正糖对照组(P<0.05),呈时间-浓度依赖趋势。5)流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测高糖对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响正糖对照组(5.5mmol／L葡萄糖)和高糖组细胞凋亡率均随培养时间的延长而递增。与同时间点正糖对照组比较,不同浓度高糖组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增高(P<0.05),并呈时间-浓度依赖趋势。6)流式细胞术(碘化丙啶染色法)检测高糖对人脐静脉内皮细胞周期分布的影响正糖对照组(5.5mmol／L葡萄糖)和高糖组细胞培养24h细胞周期未见明显改变；培养48h～96h,与同时间点正糖对照组比较,高糖组G0／G1期细胞比例增加,S和G2／M期细胞比例下降,且具有浓度依赖趋势。2、护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制1)流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞凋亡的影响正糖对照组、高糖组、高糖+护骨素组、高渗对照组各组细胞培养48h,流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞凋亡率。结果显示,与正糖对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；高糖+护骨素组细胞凋亡率明显低于高糖组(P<0.05),而又高于正糖对照组(P<0.05),并呈浓度依赖趋势；高渗对照组内皮细胞凋亡率与正糖对照组比较无统计学差异(P>0.05)。2) Hoechst33258染色观察护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞凋亡的影响各组细胞经DNA荧光染料Hoechst33258染色后,在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化。结果显示,正常细胞核内DNA分布相对均匀,核无固缩,在视野中呈现体积较大的浅染核形态,而凋亡细胞核内DNA浓聚,核出现不同程度的固缩,在视野中呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的深染核形态,有细胞凋亡的典型特征。正糖对照组细胞偶有凋亡；高糖组细胞凋亡明显增多；高糖+护骨素组细胞凋亡较高糖组有所减轻,但凋亡细胞仍多于正糖对照组；高渗对照组与正糖对照组比较无明显差异。3)划痕实验观察护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞迁移力的影响正糖对照组、高糖组、高糖+护骨素组各组细胞培养24h,倒置相差显微镜下观察划痕处的细胞生长情况并拍照,通过对比同一空间位置不同时间点拍下的照片得到细胞迁移的数据,以划痕宽度变化表示细胞迁移力的大小,划痕宽度变化愈大,则表示细胞迁移力愈强。结果显示,与正糖对照组相比,高糖组内皮细胞迁移力减弱；高糖+护骨素组细胞迁移力低于正糖对照组,而又高于高糖组。4) Western blot检测人脐静脉内皮细胞马铃薯球蛋白(Tuberin)、磷酸化马铃薯球蛋白(P-Tuberin)、核糖体蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化核糖体蛋白S6激酶(P-S6K)、Bcl-2、Bax蛋白表达为探讨护骨素对高糖环境人脐静脉内皮细胞保护作用的机制,Western blot检测mTORC1上游Tuberin、P-Tuberin和mTORC1下游S6K、P-S6K蛋白表达水平；为阐明Tuberin/S6K是否激活凋亡相关通路,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平；为进一步研究抑制mTORC1途径是否能阻滞凋亡相关通路的激活,10ng／mL雷帕霉素预培养细胞24h,再给予33mmol／L葡萄糖培养48h,Western blot检测人脐静脉内皮细胞Tuberin、P-Tuberin、S6K、P-S6K、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果显示,与正糖对照组比较,高糖组P-Tuberin、 P-Tuberin/Tuberin、S6K、P-S6K/S6K、Bax表达水平显著增高(P<0.05),Bcl-2表达显著降低(P<0.05)；高糖+护骨素组P-Tuberin、P-Tuberin/Tuberin、S6K、 P-S6K/S6K、Bax表达水平明显低于高糖组,而又高于正糖对照组(P<0.05)Bcl-2表达明显高于高糖组,而又低于正糖对照组(P<0.05)；高糖+雷帕霉素组与高糖+护骨素组相比无统计学差异(P>0.05)。[结论]1、高糖作用下,体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖降低、凋亡增加、细胞周期阻滞在G1／S期,并呈时间-浓度依赖趋势；33mmol／L葡萄糖浓度、48h作用时间点可能是体外人脐静脉内皮细胞高糖损伤模型的合适实验条件。2、高糖环境人脐静脉内皮细胞凋亡增加,其机制可能与高糖激活人脐静脉内皮细胞TSC-mTORC1活性,进而上调Bax、下调Bcl-2表达从而诱导细胞凋亡有关。3、护骨素对体外高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞具有保护作用,其机制可能通过下调TSC-mTORC1活性进而降低Bax、增加Bcl-2表达从而实现对高糖损伤的血管内皮细胞的保护效应。