论文部分内容阅读
齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）,属于鲤形目，鲤科（Cyprinidae），裂腹鱼亚科（Schizothoracinae），裂腹鱼属（Schizothorax）。分布于长江上游、任河、大渡河、岷江、青衣江、金沙江、酋水及乌江下游等水域。齐口裂腹鱼是底层栖性鱼类,生活在水温环境较低，生活在急缓流交界处，有短距离的生殖洄游现象。含氧量高的山区河流中,属于冷水性鱼类。胰蛋白酶（trypsin）是消化酶的一种，属于丝氨酸蛋白酶家族，是动物消化道中一种主要的碱性蛋白水解酶。胰蛋白酶原前体（Pretrypsinogen）拥有相等的247个氨基酸，去掉15个氨基酸（Aa）的信号肽形成胰蛋白酶原，胰蛋白酶原的N-末端被水解下来活化肽（trypsinogen activation peptide，TAP）后形成胰蛋白酶。本研究从分子水平具体阐明齐口裂腹鱼胰蛋白酶作用机制，建立一定的分子生物学基础。以齐口裂腹鱼等名优鱼类养殖过程中的生物饲料技术和渔业废弃物的利用提供理论或现实基础，同时该研究对于阐明脊椎动物胰蛋白酶原前体基因的分子进化也有一定的学术意义。本研究运用RACE技术克隆了齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体基因，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了分析。在多重比对鲤科鱼类的胰蛋白酶原前体基因后设计了巢式中间片段引物，以来自齐口裂腹鱼胰脏组织的mRNA为模扳扩增得到了齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体中间片段的序列。根据中间片段cDNA的序列设计了2条特异性3’RACE引物、2条5’RACE特异性引物，从而得到了胭脂鱼胰蛋白酶原前体的3’端序列和5’端序列。经过拼接得到齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体全长cDNA。根据拼接得到的cDNA设计验证引物，经验证结果正确。齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体基因cDNA的全序列信息为：cDNA全长为931bp，其中5’端非编码区有63bp，蛋白质编码区有741bp，3’端非编码区有127bp。齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体基因开放阅读框编码246个氨基酸，包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的激活肽。所得序列具有丝氨酸蛋白酶的保守序列：所得序列具有丝氨酸蛋白酶的保守序列：（1）含有保守的His（H63），Asp（D107）和Ser（S200）活性三联体（2）具有典型的保守的底物结合位点Asp（D194），该残基位于底物结合沟的底部，并通过电荷作用而稳定底物裂解位点的Lys或Arg残基，因而也决定着胰蛋白酶的专一性（3）开放阅读框编码256个氨基酸，包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的激活肽。（4）具有6个二硫键，其基因基本结构和从其它脊椎动物中克隆的胰蛋白酶原前体的基因结构一致。齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体的氨基酸序列与许多动物的胰蛋白酶原前体基因具有较强的相似性。尤其是底物作用位点和活性三联体是完全保守的。除此之外在底物作用位点附近的一些氨基酸残基也具有比较高的保守性，还有丝氨酸家族特有的组成3个二硫键的6个半胱氨酸残基在所有真核动物中都是保守的，脊椎动物中一般都有6个二硫键，这些位点的氨基酸残基也非常保守。用DNAstar软件的MgeAlign对几种脊椎动物胰蛋白酶进行相似性和趋异性比较发现。除了那些特殊位点之外，组成脊椎动物的胰蛋白酶原前体的氨基酸并不是特别保守，齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体的氨基酸序列与中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis胰蛋白酶原前体的相似率最高为90%，其次是斑马鱼Danio相似率为86%，与胭脂鱼Myxocyprinus asiaticus为85%。系统进化树分析胰蛋白酶原前体总体表现为不同目间的亲缘关系最远，同属内种间亲缘关系最近，同目内科间亲缘关系次之，。在胰蛋白酶上体现的进化趋势为：依次分化出了软骨鱼，硬骨鱼，两栖类和鸟类，最终分化出了哺乳动物。对预测得到的胰蛋白酶原前体基因氨基酸序列进行分析，得到蛋白的基本参数，其原子组成为C1146H1792N320O36S18,分子量Mw=26469.8Da，等电点pl=6.85。氨基酸组成中，含量最高的氨基酸是丝氨酸（Ser）占13％；其次是甘氨酸（Gly）占8.9%,天冬酰氨（Asn）和（Ala）都占7.3%；含量最低的氨基酸是组氨酸（His）和色氨酸（Trp）仅为l.6％。从整体看，碱性氨基酸（组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg）占8．6％，酸性氨基酸（天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu）占7％，这与胰蛋白酶是一种碱性氨基酸相吻合。齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体蛋白质的二级结构主要由四种形式组成，即a-螺旋（Alpha helix）占10.16％；随机卷曲（random coil）占60.16％：延伸链（extendedstrand）占29．67％。可以看出，在齐口裂腹鱼胰蛋白酶原前体蛋白的二级结构中延伸链和随机卷曲所占比例相当高，延伸链主要位于a一螺旋和随机卷曲之间。齐口裂腹鱼的胰蛋白酶原前体在胰脏，前肠，中肠和后肠中表达量最高，在肝脏、肾、脾中表达量次之，在心、脑中表达量少，在腮中表达量基本没有。