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人们一直认为水分是通过脂质双层自由扩散进入细胞。近年来,大量的实验表明,质膜中存在水通道蛋白,水分可以通过水通道蛋白进入细胞,这与自由扩散有明显的区别。水通道蛋白是一类能促进水、甘油等小分子代谢物运输的膜通道蛋白家族,在植物体内主要是促进水的转运,调节细胞的渗透势。高等植物根是进行水分运输的主要器官,在几乎所有的根细胞中都发现了水通道蛋白。因此,水通道蛋白在根对水分的吸收功能上起着重要作用。
属于十字花科的高寒冰缘植物高山离子芥(Chorispora bungeana)是生长在冰川前沿冻融带的一年生草本植物。虽没有特殊的形态结构和生长习性却能抵御强烈的紫外线照射和长期的低温胁迫。本实验克隆了高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因和启动子,并通过RT-PCR、Westem blot、转基因等分析方法研究了二者的功能。研究结果如下:
(1)通过高山离子芥根cDNA,获得了高山离子芥ChlRB7基因,全长1004bp,其中包括753bp的开放阅读框(ORF),104bp的5’非翻译区(5UTR),173bp的3’非翻译区(3UTR),包括24bp的poly(A)。该基因编码251个氨基酸的蛋白,分子量(Mw)为24.97kDa,等电点(pI)为5.30。实验结果表明该基因与拟南芥TIPs,胡萝卜DcRB7基因,烟草TobRB7基因,向日葵SunRB7基因,番茄RB7基因,马铃薯potRB7基因同源性分别高达92%,65%,64.3%,62.2%,63.6%,64%。命名为ChlRB7。ChlRB7包含有水通道蛋白2个特异基序NPA(Asn-Pro-Ala,NPA),其中该蛋白跨膜7次,具有6个跨膜螺旋区和2个膜内区,N-端和C-端都在胞内,由此说明该基因编码一个水通道蛋白。
(2)应用SOPMA在线分析工具,预测了ChlRB7基因蛋白二级结构,结果表明,ChIRB7蛋白二级结构包含有α-螺旋(Alpha helix)35.2%,伸展连(Extended strand)22.8%和β-转角(Beta turn)4.80%,自由卷曲(Random coil)37.2%。α-螺旋(Alpha helix)35.2%和自由卷曲(Random coil)37.2%为该蛋白主要二级结构。
(3)通过高山离子芥基因组DNA,获得了ChlRB7基因上游768bp的启动子序列,命名为P7-2。结果显示该序列包含有TATA-box,CAAT-box等启动子的特征元件,其中有13个Dof蛋白结合位点、6个RolD基序和2个RHEs基序,它们都与基因根特异性表达调控有关;
(4)通过免疫实验得到了ChlRB7蛋白抗体。半定量RT-PCR结果显示,ChlRB7基因仅在高山离子芥根中表达。Westem blot结果显示,高山离子芥ChlRB7基因蛋白仅在高山离子芥根中表达,由此,表明ChlRB7基因表达的根特异性。
(5)构建了转基因植物表达载体PBIGFP和PBIGFPP7-2,利用基因枪法将这两个载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达检测。结果显示,转入载体PBIGFP的洋葱表皮细胞中GFP蛋白高效大量表达。转入载体PBIGFPP7-2的洋葱表皮细胞中GFP蛋白也表达,但没有PBIGFP载体的GFP蛋白表达高。这表明P7-2启动子调控GFP的效率相对于CaMV35S要弱。
(6)构建了转基因植物表达载体PBIP7-2,利用叶盘法将PBIP7-2和PBI121两个载体分别转入烟草T12叶片。结果表明,两个载体转入烟草叶片后都能很快产生愈伤组织并分化得到幼苗。PCR检测显示,能在14d左右长出根系的再生苗基本都是阳性转基因植株。由此,表明我们获得了转基因烟草株系。
(7)分别将PBI121和PBIP7-2的转基因再生全植株用X-gluc化学组织染色,结果显示PBI121转基因植株的根、茎、叶中都有代表GUS表达蛋白的蓝色出现。而PBIP7-2转基因植物仅在根中有代表GUS表达蛋白蓝色出现。说明,P7-2启动子具有调控下游基因的特异表达特性。
(8)分别将PB1121和PBIP7-2的转基因全植株制作石蜡切片,番红染色后在显微镜下观察。结果显示,在PBI121的转基因植株根、茎、叶中都有明显的GUS蓝色出现,而PBIP7-2的转基因植株仅根中有蓝色出现。这进一步说明,P7-2启动子具有调控下游基因的根特异表达特性。
综上所述,我们从高山离子芥中克隆了根特表达水通道蛋白基因ChIRB7和启动子P7-2。ChlRB7基因的表达具有根特异表达的组织特异性,ChlRB7基因蛋白具有水通道蛋白的2个特征基序NPA。P7-2启动子具有启动子特征序列CAAT-box,TATA-box等顺式表达元件,能够调控下游基因的根特异性表达。因此, ChlRB7和P7-2在高山离子芥应答环境胁迫过程中发挥着重要的作用,具有一定的理论意义和应用前景。